Il test ossidasi rileva la presenza di un sistema citocromo ossidasi che catalizzerà il trasporto di elettroni tra donatori di elettroni nei batteri e un colorante redox – tetrametil-p-fenilene-diammina. Il colorante è ridotto al colore viola intenso., Questo test è utilizzato per aiutare nell’identificazione di Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella e Pasteurella, che producono l’enzima citocromo ossidasi.

Per questo test è possibile utilizzare un certo numero di reagenti.,

• Kovacs Oxidase Reagent:

1% tetra-methyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water

• Gordon and McLeod’s Reagent:

1% dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water

• Gaby and Hadley (indophenol oxidase) Reagent:

1% α-naphthol in 95% ethanol

1% p-aminodimethylaniline HCL

Principle of Oxidase Test

Cytochrome containing organisms produce an intracellular oxidase enzyme. This oxidase enzyme catalyzes the oxidation of cytochrome c., Gli organismi che contengono il citocromo c come parte della loro catena respiratoria sono ossidasi-positivi e trasformano il reagente in blu / viola. Gli organismi privi di citocromo c come parte della loro catena respiratoria non ossidano il reagente, lasciandolo incolore entro i limiti del test e sono ossidasi-negativi.

I batteri ossidasi positivi possiedono citocromo ossidasi o indofenolo ossidasi (un’emoproteina contenente ferro). Entrambi catalizzano il trasporto di elettroni dai composti donatori (NADH) agli accettori di elettroni (solitamente ossigeno)., Il reagente di prova, N, N, N’, N ‘ -tetrametil-p-fenilendiammina dicloridrato agisce come un accettore elettronico artificiale per l’enzima ossidasi. Il reagente ossidato forma il composto colorato indofenolo blu.

Il sistema citocromo è solitamente presente solo in organismi aerobici che sono in grado di utilizzare l’ossigeno come recettore finale dell’idrogeno. Il prodotto finale di questo metabolismo è acqua o perossido di idrogeno (suddiviso per catalasi).

Scopo / Usi del test dell’ossidasi

• Il test dell’ossidasi viene utilizzato per determinare se un organismo possiede l’enzima citocromo ossidasi.,
• Il test viene utilizzato come ausilio per la differenziazione delle specie Neisseria, Moraxella, Campylobacter e Pasteurella (ossidasi positiva).
• È anche usato per differenziare gli pseudomonadi dalle specie affini.

Procedura del test dell’ossidasi

Esistono molte varianti del metodo al test dell’ossidasi. Questi includono, ma non sono limitati a, la prova della carta da filtro, il metodo diretto del piatto, il metodo del tampone, il metodo impregnato della striscia di prova dell’ossidasi ed il metodo della provetta. Tutti i tempi e le concentrazioni si basano sulle raccomandazioni originali.,

Metodo carta da filtro a secco

Poiché il reagente ossidasi è instabile e deve essere preparato al momento per l’uso, questo metodo è conveniente.

1. La striscia di carta da filtro n.1 di Whatman viene immersa in una soluzione all ‘ 1% appena preparata di dicloridrato di tertrametil-p-fenilene-diammina.
2. Dopo lo scarico per circa 30 secondi, le strisce vengono liofilizzate e conservate in un flacone scuro ben sigillato con un tappo a vite.
3. Per l’uso, una striscia viene rimossa, posta in una capsula di petri e inumidita con acqua distillata.,
4. La colonia da testare viene prelevata con un anello di platino e spalmata sulla zona umida.
5. Una reazione positiva è indicata da un’intensa tonalità viola intenso, che appare entro 5-10 secondi, una reazione “positiva ritardata” per colorazione in 10-60 secondi e una reazione negativa per assenza di colorazione o colorazione dopo 60 secondi.

Metodo della carta da filtro bagnata

1. Una striscia di carta da filtro viene imbevuta di una piccola soluzione all ‘ 1% appena preparata del reagente.
2. Un granello di cultura viene strofinato su di esso con un anello di platino.,
3. Una reazione positiva è indicata da un’intensa tonalità viola intenso, che appare entro 5-10 secondi, una reazione “positiva ritardata” per colorazione in 10-60 secondi e una reazione negativa per assenza di colorazione o colorazione dopo 60 secondi.

Metodo diretto della piastra

1. Aggiungere 2 -3 gocce di reagente direttamente alle colonie sospette su una piastra di agar. Non inondare la piastra con il reagente.
2. Osservare per il cambiamento di colore entro 10 secondi.

Nota: Il metodo della piastra diretta deve essere eseguito su una piastra di agar non selettiva.,

1. Quando si utilizza il reagente ossidasi di Kovac, i microrganismi sono ossidasi positivi quando il colore diventa viola scuro entro 5-10 secondi. I microrganismi sono ritardati ossidasi positiva quando il colore cambia in viola entro 60 a 90 secondi. I microrganismi sono ossidasi negativi se il colore non cambia o richiede più di 2 minuti.
2. Quando si utilizza il reagente Gordon e McLeod, i microrganismi sono ossidasi positivi quando il colore cambia in rosso entro 10-30 minuti o in nero entro 60 minuti. I microrganismi sono ossidasi negativi se il colore non cambia.,

Metodo tampone

1. Immergere il tampone nel reagente e quindi toccare una colonia sospetta isolata
2. Osservare il cambiamento di colore entro 10 secondi.

Metodo in provetta

1. Coltivare una coltura fresca (da 18 a 24 ore) di batteri in 4,5 ml di brodo nutriente (o supporti standard che non contengono un’alta concentrazione di zucchero).
2. Aggiungere 0,2 ml di α-naftolo all ‘1%, quindi aggiungere 0,3 ml di ossalato di p-aminodimetilanilina all’ 1% (reagenti Gaby e Hadley).
3. Agitare energicamente per garantire la miscelazione e l’ossigenazione completa della coltura.,
4. Osservare per i cambiamenti di colore.
5. I microrganismi sono ossidasi positivi quando il colore diventa blu entro 15-30 secondi. I microrganismi sono ritardati ossidasi positiva quando il colore cambia in viola entro 2 o 3 minuti. I microrganismi sono ossidasi negativi se il colore non cambia.

Interpretazione del risultato del test dell’ossidasi

Risultato positivo

Lo sviluppo di un colore viola-blu / blu intenso indica la produzione di ossidasi entro 5-10 secondi.

Risultato negativo

Nessun colore viola-blu / Nessun cambiamento di colore.,

Examples

Oxidase Positive Organisms: Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella, Pasteurella, Moraxella, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, etc.

Oxidase Negative Organisms: Enterobacteriaceae (e.g. E., coli)

Controllo di Qualità per il Test dell’Ossidasi

Controllo Positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Controllo Negativo: Escherichia coli ATCC 25922

Limitazioni del Test dell’Ossidasi

1. I reagenti utilizzati nel test dell’ossidasi hanno dimostrato di auto-ossidazione, quindi è molto importante l’uso di reagenti freschi, meno di 1 settimana.
2. Sia i batteri che il lievito coltivati su supporti contenenti alte concentrazioni di glucosio mostrano un’attività ossidasi inibita, quindi si consiglia di testare le colonie coltivate su supporti senza zucchero in eccesso, come l’agar nutriente., L’agar di soia triptica è anche un supporto eccellente.
3. I batteri coltivati su supporti contenenti coloranti possono dare risultati aberranti.
4. I reagenti del test uccideranno efficacemente i microrganismi, quindi la sub-coltura dovrebbe essere eseguita prima di aggiungere qualsiasi reagente a una coltura attiva.
5. Il test dell’ossidasi può essere utilizzato nell’identificazione presuntiva di Neisseria e nella differenziazione e identificazione dei bacilli gram-negativi. Gli organismi ossidasi-positivi dovrebbero essere esaminati dalla macchia di gram per determinare la morfologia e la reazione di gram., Ulteriori test biochimici sono raccomandati per l’identificazione completa.
6. L’uso di un nicromo o di un altro anello contenente ferro può produrre reazioni false-positive. Si raccomandano anelli di platino.
7. La maggior parte degli Haemophilus sono ossidasi-positivi. Strisce o reagenti meno sensibili possono produrre risultati falsi negativi.
8. Le reazioni ossidasi dei bacilli gram-negativi devono essere determinate su supporti non selettivi e non differenziali per garantire risultati validi. Inoltre, le colonie prelevate da terreni contenenti alti livelli di glucosio possono dare reazioni false-negative.,
9. Si consiglia di utilizzare colonie che hanno 18-24 ore. Le colonie più vecchie produrranno reazioni più deboli.
10. Eventuali cambiamenti di colore che compaiono dopo 20 secondi devono essere ignorati.