I metodi di sequenziamento di nuova generazione (NGS) hanno iniziato ad apparire in letteratura a metà degli anni 2000 e hanno avuto un effetto trasformativo sulla nostra comprensione della genomica microbica e delle malattie infettive. C’è comunque una notevole controversia su come, quando e dove il sequenziamento di prossima generazione avrà un ruolo nel laboratorio diagnostico clinico., Una profonda dive punto-contrappunto discussione dal Journal of Clinical Microbiology discute le sfide e le opportunità che possono venire con l’introduzione di metagenomic next generation sequencing (mNGS) nei laboratori di routine. Che cosa è esattamente mNGS e come è diverso dalle molte altre tecnologie di acido nucleico là fuori?

Che cos’è il sequenziamento metagenomico di nuova generazione?

Il sequenziamento di nuova generazione è uno dei diversi metodi di sequenziamento ad alto throughput per cui miliardi di frammenti di acido nucleico possono essere sequenziati simultaneamente e indipendentemente., Contrasto questa tecnica a metodi classici come Sanger sequenziamento (noto anche come catena dideoxynucleotide terminazione sequenziamento), che elabora una sequenza nucleotidica per reazione.
Per caratterizzare un genoma batterico utilizzando NGS, ad esempio, il genoma è diviso in più frammenti che producono sequenze o letture che vanno da centinaia a decine di migliaia di basi di lunghezza. Le sequenze sono assemblate in un singolo genoma utilizzando approcci computazionali. Diverse letture di sequenze sovrapposte vengono messe insieme per produrre una singola sequenza più lunga chiamata contig., Ci sono spesso spazi tra contig e anche se ad alta fedeltà letture di sequenza più lunghe sarebbe il metodo ideale di sequenziamento, piattaforme che producono letture più brevi sono generalmente meno costosi e la sovrapposizione in sequenze li rende più precisi. Il genoma costruito (probabilmente contenente lacune) è allineato a un database di riferimento per l’identificazione dell’organismo. Questa tecnologia rappresenta un notevole progresso rispetto ai primi giorni di sequenziamento quando un singolo progetto genoma batterico potrebbe richiedere diversi anni.,
Metagenomic NGS (mNGS) è semplicemente in esecuzione tutti gli acidi nucleici in un campione, che può contenere popolazioni miste di microrganismi, e assegnando questi ai loro genomi di riferimento per capire quali microbi sono presenti e in quali proporzioni. La capacità di sequenziare e identificare gli acidi nucleici da più taxa diversi per l’analisi metagenomica rende questa una nuova potente piattaforma in grado di identificare simultaneamente materiale genetico da regni di organismi completamente diversi.,

Le possibili applicazioni cliniche sono enormi, tra cui la diagnosi di malattie infettive, il monitoraggio delle epidemie, la sorveglianza del controllo delle infezioni e la scoperta di mutazioni e patogeni, tra molti altri. mNGS, a volte chiamato sequenziamento shotgun, di campioni clinici è stato applicato a vari tipi di campioni tra cui liquido cerebrospinale, sangue, campioni respiratori, liquido gastrointestinale e liquido oculare.

Quali sono i vantaggi del sequenziamento metagenomico di prossima generazione?,

La più grande forza di mNGS è che è un metodo diagnostico senza ipotesi imparziale, a differenza dei metodi mirati di reazione a catena della polimerasi (PCR) che si basano su primer per l’identificazione di obiettivi specifici da amplificare e rilevare. Anche i metodi PCR universali o ad ampio raggio non sono sufficientemente ampi per essere considerati metagenomici, poiché utilizzano primer specifici del gene rRNA (ribosomal RNA) conservato 16S e sequenze di spaziatori trascritti interni (ITS) per amplificare sequenze di acidi nucleici distintivi che possono essere classificati bioinformaticamente in batteri/archaea o funghi rispettivamente.,
I primer universali rappresentano anche un problema quando si diagnosticano infezioni polimicrobiche con test molecolari. Se sono presenti popolazioni polimicrobiche quando si utilizza il sequenziamento 16S, verranno effettuate più chiamate di base per nucleotide, producendo un cromatogramma nucleotidico misto che non può essere interpretato. Mentre ci sono metodi computazionali de-convoluzionali disponibili per prevedere gli organismi identificati, questi non sono in uso standard per molti laboratori, che spesso riflesso al sequenziamento di prossima generazione del gene 16S per campioni polimicrobici.,

Quali sono le sfide del sequenziamento metagenomico di nuova generazione?

Nonostante il potenziale di mNGS, ci sono molte barriere per cancellare prima che la tecnologia può diventare parte del laboratorio mainstream, così come le lacune nella nostra comprensione circa la sua utilità diagnostica. Le principali riserve includono l’interpretazione dei risultati (distinguendo la contaminazione e la colonizzazione dai veri agenti patogeni), la selezione e la validazione delle banche dati utilizzate per le analisi e la previsione (o la loro mancanza) delle suscettibilità antimicrobiche., Una percezione comune è che mNGS è così incredibilmente sensibile che rivelerà una diagnosi quando tutti gli altri test è negativo. Mentre gli MNG possono essere analiticamente più sensibili rispetto ai metodi di coltura standard in alcuni casi, la necessaria rimozione di grandi quantità di acido nucleico umano durante la preparazione del sequenziamento e (con metodi computazionali) durante il processo post-analitico, può diminuire la sensibilità rispetto agli approcci PCR mirati per molti organismi.

La specificità di mNGS rimane l’elefante proverbiale nella stanza., La contaminazione dei campioni durante la raccolta dei campioni è una grande preoccupazione data la maggiore sensibilità analitica degli MNG rispetto ai metodi di coltura standard e deve essere applicato un processo di controllo della qualità convalidato per le fasi dalla valutazione della purezza del reagente alla misurazione di adeguati controlli di copertura del genoma. Inoltre, con alcune piattaforme Illumina, gli indici di codici a barre errati possono essere designati, portando a falsi positivi sui dati di sequenziamento., I controlli di qualità bioinformatici sono necessari per garantire che genomi di alta qualità e convalidati siano disponibili con errori minimi di database e idealmente ci sarebbe personale bioinformatico disponibile per interpretare i risultati di sequenziamento per ogni test, che non è disponibile nella maggior parte dei laboratori microbiologici clinici., La Federal Drug Administration (FDA) ha collaborato con altre agenzie federali per curare un database intitolato FDA-ARGOS (FDA-database for regulatory-grade microbial sequences), che è stato utile per garantire che gli attuali risultati mNGS siano affidabili e accurati, ma queste risorse devono essere aggiornate e mantenute.
La domanda più grande rimane che circonda la specificità clinica di mNGS: Sono le sequenze rilevate da agenti patogeni che stanno contribuendo alla malattia attuale del paziente?, La specificità analitica dei test mNGS può essere affrontata con controlli rigorosi durante la raccolta dei campioni, la preparazione della libreria di sequenziamento, l’esecuzione del test e la classificazione bioinformatica, ma la specificità clinica non viene affrontata direttamente da questi approcci. Le domande che possono aiutare a determinare l’utilità clinica e l’applicabilità includono: Come possiamo distinguere gli organismi correlati alla batteriemia transitoria dalla flora orale / gastrointestinale o dai colonizzatori della pelle nei test mNGS di sangue/plasma?, Come dovrebbe essere riportata la profondità di sequenziamento e quanto è affidabile la relazione tra la profondità della sequenza e la vera infezione? Questa relazione differisce per agente patogeno / ospite? Quanto dura l’emivita rilevabile prevista di un agente patogeno da mNGS una volta che il paziente riceve una terapia curativa appropriata? Gli studi sull’utilità clinica e sull’efficacia dei costi sono molto necessari nonostante l’indiscutibile potere di questa tecnologia dal punto di vista della ricerca e della scoperta.,
Vale anche la pena sottolineare che non esistono attualmente test mNGS approvati o approvati dalla FDA che possono essere inviati per test microbici, anche se ci sono laboratori certificati sotto gli emendamenti di miglioramento del laboratorio clinico del 1988 (CLIA ’88) che offrono test su campioni clinici. Ad oggi, solo pochi sistemi diagnostici NGS sono stati autorizzati dalla FDA per i test oncologici o il rilevamento della fibrosi cistica, ad esempio., Una recente revisione descrive in dettaglio molti degli ostacoli normativi e considerazioni che dovranno essere affrontati prima che le MNG possano entrare nei laboratori diagnostici clinici tradizionali come test convalidato dalla FDA.
In sintesi, mentre i test mNGS potrebbero probabilmente svolgere un ruolo importante nel flusso di lavoro diagnostico microbiologico in futuro, in particolare con l’evoluzione del sequenziamento e della potenza di elaborazione bioinformatica, questa rimane una tecnologia ad alta complessità per la quale l’utilità clinica nel nostro attuale ambiente di pratica medica rimane incerta., Sebbene i test mNGS possano offrire nuove ed eccitanti opportunità cliniche diagnostiche nel prossimo futuro, nessuno di essi sostituirà probabilmente un medico astuto in qualunque momento presto.