Figura 1. La struttura di dominio di MmpA, MmpC e MmpD per la sintesi di acido monico. La biosintesi dell’acido monico non è colineare ma è stata riorganizzata in questo diagramma. Il nome della proteina viene visualizzato all’interno della freccia con il modulo e la struttura del dominio elencati di seguito. ACP = proteina portatrice di acile, AT = transferasi di acile, DH=disidratasi, ER=enoil reduttasi, HMG=acido 3-idrossi-3-metilglutarico, MeT=transferasi di metile, KR=chetoreduttasi, KS=chetosintasi, TE = tioesterasi.,
Figura 2. La struttura dell’acido pseudomonico A-D, etichettato da A a D, rispettivamente.
Figura 3. Il gruppo metilico C15 dell’acido monico è attaccato a C3 dal seguente schema di reazione. MupH è un idrossimetilglutaril-coenzima A sintasi, MupJ e MupK sono Enoil-CoA idratasi.
Figura 4. L’anello piranico della mupirocina viene generato in questa reazione multistep proposta., I knockout genici di mupO, mupU, mupV e macpE aboliscono la produzione PA-A ma non la produzione PA-B, dimostrando che PA-B è un precursore di PA-A.
Figura 5. MmpB si propone di sintetizzare 9-HN con un’unità di avviamento 3-idrossi-propionato e tre unità di estensione malonyl-CoA. La struttura di dominio di MmpB è mostrata sotto insieme a MupE, la proposta enoyl reduttasi richiesta per la completa saturazione di 9-HN. ACP = proteina portatrice di acile, DH = disidratasi, ER = enoil reduttasi, KR=chetoreduttasi, KS=chetosintasi, TE = tioesterasi.,
La mupirocina è una miscela di diversi acidi pseudomonici, con acido pseudomonico A (PA-A) che costituisce più del 90% della miscela. Presente anche in mupirocina sono acido pseudomonico B con un ulteriore gruppo idrossile a C8, acido pseudomonico C con un doppio legame tra C10 e C11, invece dell’epossido di PA-A, e acido pseudomonico D con un doppio legame a C4 ‘e C5’ nella porzione di acido 9-idrossi-nonanoico di mupirocina.,
Biosintesi dell’acido pseudomonico AEdit
Il cluster genico di mupirocina da 74 kb contiene sei enzimi multi-dominio e ventisei altri peptidi (Tabella 1). Sono codificate quattro grandi proteine multi-dominio di polichetide sintasi di tipo I (PKS), così come diversi enzimi a funzione singola con somiglianza di sequenza con PKS di tipo II. Pertanto, si ritiene che la mupirocina sia costruita da un sistema misto di tipo I e tipo II PKS. Il cluster di mupirocina presenta un’organizzazione atipica di aciltransferasi (AT), in quanto ci sono solo due domini AT ed entrambi si trovano sulla stessa proteina, MmpC., Questi domini AT sono gli unici domini presenti su MmpC, mentre le altre tre proteine PKS di tipo I non contengono domini AT. La via di mupirocina inoltre contiene parecchi doppietti o tripletti tandem della proteina del trasportatore di acile. Questo può essere un adattamento per aumentare la velocità di trasmissione o per legare più substrati contemporaneamente.
L’acido pseudomonico A è il prodotto di un’esterificazione tra l’acido monico polichetide 17C e l’acido grasso 9C acido 9-idrossi-nonanoico., La possibilità che l’intera molecola sia assemblata come un singolo polichetide con un’ossidazione di Baeyer-Villiger che inserisce un ossigeno nella spina dorsale del carbonio è stata esclusa perché C1 di acido monico e C9′ di acido 9-idrossi-nonanoico sono entrambi derivati da C1 di acetato.,
Monic acid biosynthesisEdit
Biosynthesis of the 17C monic acid unit begins on MmpD (Figure 1)., Uno dei domini AT di MmpC può trasferire un gruppo acetilico attivato dall’acetil-Coenzima A (CoA) al primo dominio ACP. La catena è estesa da malonyl-CoA, seguita da una metilazione SAM-dipendente a C12 (vedi Figura 2 per la numerazione PA-A) e riduzione del gruppo B-cheto ad un alcol. Si prevede che il dominio di disidratazione (DH) nel modulo 1 non sia funzionale a causa di una mutazione nella regione del sito attivo conservato. Il modulo 2 aggiunge altri due carboni dall’unità di estensione malonyl-CoA, seguita da ketoreduzione (KR) e disidratazione., Il modulo tre aggiunge un’unità di estensione malonyl-CoA, seguita da metilazione SAM-dipendente a C8, ketoreduzione e disidratazione. Il modulo 4 estende la molecola con un’unità di malonil-CoA seguita da ketoreduzione.
L’assemblaggio dell’acido monico viene continuato dal trasferimento del prodotto 12C di MmpD a MmpA. Altri due turni di estensione con unità di malonyl-CoA sono raggiunti dai moduli 5 e 6. Il modulo 5 contiene anche un dominio KR.
Post-PKS tailoringEdit
Il gruppo cheto a C3 viene sostituito con un gruppo metilico in una reazione a più fasi (Figura 3). MupG inizia decarbossilando un malonil-ACP., Il carbonio alfa dell’acetil-ACP risultante è collegato a C3 della catena del polichetide da MupH. Questo intermedio è disidratato e decarbossilato da MupJ e MupK, rispettivamente.
La formazione dell’anello pirano richiede molti passaggi mediati dagli enzimi (Figura 4). Il doppio legame tra C8 e C9 è proposto per migrare tra C8 e C16. Gli esperimenti Gene knockout di mupO, mupU,mupV e macpE hanno eliminato la produzione di PA-A. La produzione di PA-B non viene rimossa da questi knockout, dimostrando che PA-B non viene creato idrossilando PA-A., Un knockout di mupW eliminò l’anello pirano, identificando MupW come coinvolto nella formazione dell’anello. Non è noto se ciò si verifichi prima o dopo l’esterificazione dell’acido monico in acido 9-idrossi-nonanoico.
Si ritiene che l’epossido di PA-A a C10-11 sia inserito dopo la formazione di pirano da un citocromo P450 come MupO. Un knockout gene di mupO abolito PA-A produzione ma PA-B, che contiene anche il C10-C11 epossido, è rimasto. Ciò indica che MupO non è coinvolto o non è essenziale per questa fase di epossidazione.,
Biosintesi dell’acido 9-idrossi-nonanoico
L’acido grasso 9-idrossi-nonanoico a nove atomi di carbonio (9-HN) è derivato come composto separato e successivamente esterificato in acido monico per formare acido pseudomonico. 13C etichettato acetato alimentazione ha dimostrato che C1-C6 sono costruiti con acetato in modo canonico di sintesi degli acidi grassi. C7 ‘mostra solo l’etichettatura C1 dell’acetato, mentre C8 ‘e C9’ mostrano un modello invertito di acetato marcato con 13C. Si ipotizza che C7-C9 derivi da un’unità di avviamento 3-idrossipropionato, che viene estesa tre volte con malonyl-CoA e completamente ridotta per produrre 9-HN., È stato anche suggerito che 9-HN sia iniziato dall’acido 3-idrossi-3-metilglutarico (HMG). Quest’ultima teoria non è stata supportata dall’alimentazione di or-HMG.
Si propone che MmpB catalizzi la sintesi di 9-HN (Figura 5). MmpB contiene un dominio KS, KR, DH, 3 ACP e un dominio tioesterasico (TE). Non contiene un dominio di enoil reduttasi (ER), che sarebbe richiesto per la completa riduzione all’acido grasso a nove atomi di carbonio. MupE è una proteina a dominio singolo che mostra la somiglianza della sequenza con i domini ER noti e può completare la reazione., Rimane anche possibile che l’acido 9-idrossi-nonanoico sia derivato parzialmente o interamente dall’esterno del cluster di mupirocina.