Dopo aver studiato alla RADA dal 1992 al 1995, Macfadyen divenne noto nel teatro britannico principalmente per il suo lavoro con la compagnia teatrale Cheek by Jowl, per la quale interpretò Antonio in La duchessa di Malfi, Charles Surface in La scuola per lo scandalo e Benedick in Much Ado About Nothing. Il suo Benedick è stato interpretato come un buffone di classe ufficiale con i baffi e una risata ragliante. Nel 2005, ha interpretato il principe Hal in Enrico IV, Parti uno e due al Royal National Theatre, con Michael Gambon nel ruolo di Falstaff., Nel 2007, è tornato sul palco, interpretando un americano, Clay, un padre di casa con un atteggiamento liberale nello spettacolo The Pain and the Itch.
Una svolta televisiva è arrivata quando è apparso come Hareton Earnshaw in un adattamento di Wuthering Heights, proiettato sulla rete ITV nel 1998. Seguirono altri drammi televisivi, tra cui ruoli da protagonista nei drammi Warriors (1999) e The Way We Live Now (2001), entrambi per la BBC. Sempre nel 2001, ha guadagnato consensi per il suo ruolo da protagonista nel serial drammatico della BBC Two Perfect Strangers, che è stato scritto e diretto da Stephen Poliakoff., Nel 2002, ha recitato in The Project, un dramma della BBC che traccia l’ascesa al potere dei New Labour. Ha recitato in Spooks, che è diventato un successo quando proiettato su BBC One. Una seconda stagione più lunga è stata proiettata nel 2003, e una terza stagione è stata trasmessa nell’autunno 2004, con lui che ha lasciato la serie nel secondo episodio. La serie è stata trasmessa come MI-5 sulla rete A & E. Nel 2007 è apparso nel dramma one-off di Channel 4 Secret Life, che ha affrontato il controverso argomento della pedofilia., Macfadyen ha vinto il premio come miglior attore ai Royal Television Society 2007 Awards per questa parte, ed è stato nominato per un BAFTA. È apparso anche in un breve sketch per Comic Relief come lo sposo in Mr. Bean’s Wedding, al fianco di Rowan Atkinson e Michelle Ryan.
Busto di Mr. Darcy interpretato da Matthew Macfadyen in Orgoglio & Pregiudizio (2005) – film
Macfadyen è apparso in film come Enigma (pubblicato nel 2001), e Mio Padre, Den, per cui ha ricevuto la Nuova Zelanda Screen Award per il Miglior Attore., Ha interpretato il ruolo del romantico protagonista Fitzwilliam Darcy in un adattamento di Orgoglio e pregiudizio, uscito nel Regno Unito nel settembre 2005.
Macfadyen ha recitato in Morte a un funerale di Frank Oz e nel film Incendiary, basato sul romanzo di Chris Cleave insieme a Michelle Williams e Ewan McGregor. È anche apparso nel film di Ron Howard Frost / Nixon, in cui ha interpretato John Birt. Nel 2008, ha interpretato il protagonista maschile Arthur Clennam nell’adattamento della BBC di Little Dorrit di Charles Dickens., Nel 2009 Macfadyen è apparso al fianco dell’attrice premio Oscar Helena Bonham Carter nel film della BBC Four Enid, basato sulla vita di Enid Blyton, come Hugh Pollock, editore di Blyton e primo marito.
Nel 2010, ha interpretato lo sceriffo di Nottingham in Robin Hood. Ha interpretato il ruolo del priore Philip nella serie TV I pilastri della Terra, ed era il Logan Mountstuart di mezza età in Any Human Heart. Nel giugno 2010, Macfadyen ha vinto un British Academy Television Award come miglior attore non protagonista per il suo lavoro nella giustizia penale.,
Nel 2011, Macfadyen ha fatto un ultimo cameo nello show della BBC Spooks, e nel 2012, ha interpretato Stepan Arkad’ic nel film di Joe Wright, Anna Karenina. Nel dicembre 2012 ha iniziato a ritrarre l’ispettore Edmund Reid in BBC One Ripper Street.
Nel 2013-14 interpreta Jeeves nella produzione di Jeeves e Wooster in Perfect Nonsense al Duke of York’s Theatre nel West End di Londra. La commedia ha vinto l’Olivier award 2014 per la migliore nuova commedia.
Nel 2015 Amazon Prime ha raccolto Ripper Street e, dopo buone recensioni, è stato rimesso in servizio per la quarta e la quinta stagione., Macfadyen ha detto che era “felice di essere imbarcarsi su un”altra dose di Ripper Street – sangue e budella, orologi da tasca e copricapo vittoriano, meravigliosamente scuro, linee di storia in movimento e misteriose dal signor Richard Wardlow”. La serie è andata in onda anche negli Stati Uniti su BBC America. Sempre nel 2015, ha recitato come ospite nell’episodio pilota di The Last Kingdom.
Attualmente interpreta Tom Wambsgans nella serie HBO Succession, per la quale ha ricevuto una nomination ai Primetime Emmy Award.,
Nel 2020, è apparso nel ruolo del maggiore Charles Ingram in un dramma ITV in tre parti, Quiz, basato sul controverso scandalo cheat tosse su Chi vuole essere un milionario nel 2001.