Coagulasi test è l’unico metodo affidabile per l’identificazione di Staphylococcus aureus. La produzione della coagulasi può essere individuata facendo uso della prova della coagulasi della diapositiva (SCT) o della prova della coagulasi della provetta (TCT)., Slide coagulase rileva la coagulasi legata (chiamata anche “fattore di aggregazione”), che reagisce direttamente con il fibrinogeno nel plasma, causando una rapida agglutinazione cellulare. Gli isolati negativi che seguono SCT richiedono la conferma con il TCT superiore, poiché gli sforzi carenti nel fattore di aggregazione producono solitamente la coagulasi libera. La coagulasi del tubo rileva la coagulasi libera extracellulare secreta che reagisce con una sostanza nel plasma chiamata” fattore di reazione della coagulasi ” (CRF) per formare un complesso, che a sua volta reagisce con il fibrinogeno per formare la fibrina (il coagulo) ., Ceppi di stafilococchi animali coagulasi-positivi sono stati isolati da campioni clinici umani, ma alcuni isolati stafilococcici animali fermentano anche il mannitolo . Questo studio ha valutato le prestazioni di TCTS, DNasi e MSA, i metodi fenotipici comunemente usati nell’identificazione di Staphylococcus aureus.

Rilevamento di Staphylococcus aureus con i test fenotipici disponibili

PCR-l’amplificazione del gene nuc, che è stato utilizzato come test di base, ha rilevato 32 Staphylococcus aureus dei 60 isolati stafilococcici, vedere tabella 2., Dei 32 isolati di Staphylococcus aureus nuc-positivi, MSA ha rilevato il più alto numero di isolati (30 su 32, 94%) mentre il TCT (plasma umano e ovino rispettivamente) ha rilevato 29 e 27 dei 32 isolati (91% e 84% rispettivamente), tabella 2. DNase rilevato il minor numero di isolati (24 di 32, 75%).

Nove dei 32 isolati di Staphylococcus aureus positivi al nuc (28%) erano coagulasi negativi, il che implica che alcuni isolati potrebbero essere erroneamente identificati dal TCT come unico test. Lo Staphylococcus aureus coagulasi negativo può probabilmente essere isolati MRSA che sono segnalati per reagire debolmente o negativamente con TCTS, o rari ceppi di Staphylococcus aureus che sono segnalati per essere coagulasi negativo . Anche due isolati di Staphylococcus aureus (6%) sono risultati negativi alla MSA., Shittu et al hanno anche riportato Staphylococcus aureus negativo al mannitolo che era resistente alla meticillina . Inoltre, otto dei 32 isolati di Staphylococcus aureus positivi al nuc erano DNasi negativi (25%). Rao et al hanno riportato Staphylococcus aureus DNasi negativo ma senza alcuna spiegazione per questi risultati . Sei stafilococchi diversi dagli isolati di Staphylococcus aureus confermati da nuc hanno prodotto colonie gialle su MSA e risultati simili sono stati riportati da altri ricercatori . Un altro risultato raro in questo studio è stato un isolato che era DNase positivo ma MSA-negativo e tubo coagulasi-negativo (cioè., non-Staphylococcus aureus). Presumiamo che questo isolato possa essere stato Staphylococcus schleiferi subsp. coagulani, che secondo il metodo standard nazionale è anche DNasi positivo .

I singoli test fenotipici sono inefficienti per l’identificazione di Staphylococcus aureus

Abbiamo usato la sensibilità e la specificità per valutare le prestazioni dei singoli test nel rilevare lo Staphylococcus aureus., La crescita su MSA è stata la più sensibile (sensibilità 94%), seguita dal TCT (plasma umano e ovino, sensibilità 91% e 81% rispettivamente) mentre il test DNasi è stato il meno sensibile (sensibilità 75%). Al contrario, il test della DNasi era il più specifico (96% di specificità) seguito da MSA (79% di specificità), mentre il TCT (plasma umano e plasma ovino) era il meno specifico (11% e 7%, rispettivamente), tabella 3. Nel complesso, dei singoli test studiati, la crescita su MSA è stata la migliore per identificare lo Staphylococcus aureus (94% di sensibilità e 79% di specificità)., I nostri risultati differiscono leggermente da quelli di Han et al, che hanno riportato sensibilità e specificità di 76.5% e 99.6%, rispettivamente, per MSA . D’Souza et al, hanno anche riportato una sensibilità del 71%, un po ‘ inferiore alla nostra . L’elevata sensibilità della MSA nel rilevare lo Staphylococcus aureus potrebbe essere dovuta alla sua capacità di isolare lo Staphylococcus aureus patogeno, differenziando gli stafilococchi coagulasi negativi dagli stafilococchi coagulasi positivi.,

Per tubo coagulasi di plasma umano è più sensibile di pecore al plasma (91% vs 81% di sensibilità), il che implica che l’utilizzo di pecore al plasma con TCTs può rilevare un maggior numero di falsi negativi isolati. Pertanto, in questo contesto, è improbabile che il plasma di pecora sostituisca il plasma umano per i TCT di routine., I nostri dati sono in accordo con precedenti risultati in cui la sensibilità del 94-100% è stata riportata da altri ricercatori . Tuttavia, in questo studio, la sensibilità per il plasma umano e ovino è stata superiore a quella riportata in altri contesti, dove sono stati riportati valori fino al 54,5% (plasma umano) e al 45,5% (plasma ovino). Pertanto, con i test di coagulasi, le prestazioni del plasma variano con l’impostazione e la scelta del plasma può influenzare l’efficienza del test. Inoltre, l’uso di EDTA o citrato come anticoagulante influenza le prestazioni del test., Degno di nota, il citrato colpisce solo le reazioni di coagulasi degli enterococchi dove viene utilizzato , ma non influenza gli organismi produttori di coagulasi come lo Staphylococcus aureus.

Il test della DNasi aveva una sensibilità del 75% e una specificità del 96%, che sono paragonabili ad altri studi in cui sono state riportate una sensibilità del 75% e una specificità del 100%. In questo studio, il test della DNasi era il più specifico di tutti i test e aveva il minor numero di isolati falsi positivi (c’era solo un falso positivo)., Ciò era in accordo con altri rapporti, in cui il test della DNasi è stato segnalato come superiore al TCT . Anche la crescita su MSA era altamente specifica (specificità del 79%), mentre il test meno specifico era la coagulasi del tubo (plasma umano e ovino, specificità dell ‘ 11% e del 7%, rispettivamente).

Al contrario, altri studi hanno riportato un’elevata specificità (93,6%) per il plasma umano e ovino con TCTS ., La bassa specificità nel nostro studio può essere in parte dovuto alla non specifico per il rilevamento di altri coagulasi positivi stafilococchi, come lo Staphylococcus schleiferi sottospecie coagulans, Staphylococcus delphini, Staphylococcus intermedius e Staphylococcus hyicu s. Staphylococcus delphini e Staphylococcus intermedius sono rari, isolati clinici mentre Staphylococcus hyicu s è indeterminato (con una prevalenza che varia dall ‘11% all’ 89% ). La prevalenza di questi isolati può essere elevata in determinate impostazioni., Sebbene MSA e DNase avessero elevate specificità e sensibilità, come test individuali, il loro uso nell’identificazione di routine di Staphylococcus aureus è ridotto dalla loro capacità di rilevare altri isolati batterici e sono principalmente utilizzati durante gli schermi iniziali . Infatti, i contro positivi del sale del mannitolo (Staphylococcus caprae, S. hemolyticus e S. saprophyticus) sono stati riferiti in Nigeria ed in Giappone ., Così, in determinate regolazioni, se usato individualmente per identificare lo Staphylococcus aureus, le prove fenotipiche comuni possono essere insufficienti; alcuni isolati saranno erroneamente identificati, come Staphylococcus aureus o contro.

Una combinazione di MSA e DNasi migliora il test della coagulasi del tubo

Abbiamo quindi valutato la sensibilità e la specificità delle combinazioni di test (cioè MSA/DNasi/TCT) per rilevare lo Staphylococcus aureus, con l’obiettivo di migliorare le prestazioni del TCT., Abbiamo raggiunto la specificità assoluta (100%) nel rilevare Staphylococcus aureus con combinazioni di test, ad eccezione della combinazione DNasi/MSA (92% specificità). Al contrario, la sensibilità delle combinazioni di test variava, con la MSA / DNasi / TCT (plasma umano) che era la più sensibile (sensibilità del 75%), mentre la MSA/DNasi/TCT (plasma ovino) era la meno sensibile (sensibilità del 25%), tabella 3.

Una combinazione di MSA / DNasi ha determinato specificità e sensibilità del 92% e del 96%, rispettivamente, e questa sarebbe la combinazione di scelta per l’identificazione di Staphylococcus aureus., Tuttavia, poiché entrambi i test non sono specifici per lo Staphylococcus aureus e possono rilevare altri isolati batterici, la doppia combinazione può essere utilizzata solo per migliorare il TCT. Sebbene altre combinazioni di test-MSA/DNasi/TCT (plasma umano) e MSA/TCT (plasma umano) avessero una specificità del 100%, avevano una sensibilità variabile (75% e 33%, rispettivamente). In questa linea, una combinazione di MSA / DNasi / TCT (plasma umano) è migliore per identificare lo Staphylococcus aureus (specificità del 100%, sensibilità del 75%) rispetto alla combinazione MSA/TCT (plasma umano) (specificità del 100%, sensibilità del 33%)., Allo stesso modo, le combinazioni DNasi/TCT (plasma ovino) e MSA/TCT (plasma ovino) e MSA/DNasi/TCT (plasma ovino) avevano una specificità assoluta (100%) ma con sensibilità variabile (50%, 25% e 67%, rispettivamente).

Pertanto, l’efficienza della coagulasi del tubo può essere migliorata attraverso test simultanei che includono sia DNasi che MSA. Per una maggiore sensibilità e specificità, l’identificazione sequel di Staphylococcus aureus può iniziare con MSA, DNasi e poi TCT. Degno di nota, la specificità migliorata del TCT non ha alterato significativamente l’alta sensibilità inizialmente osservata., L’uso di MSA prima di TCTs/DNase è altamente raccomandato a causa del fattore di aggregazione negativo e degli stafilococchi positivi alla coagulasi del tubo che vengono sempre più recuperati dalle infezioni umane. Questi isolati producono anche una DNasi stabile al calore e possono essere erroneamente identificati come Staphylococcus aureus. Tuttavia, questi ceppi possono essere differenziati da Staphylococcus aureus dalla loro incapacità di produrre acido da maltosio, lattosio e mannitolo. Inoltre, rari ceppi di Staphylococcus aureus possono essere coagulasi negativi, ma isolati animali (S. intermidius, S. hyicus, S. delphini e S. schleiferi subsp., coagulani) può essere tubo coagulasi positivo; differenziazione di questi richiede anche la crescita su MSA.

Valori predittivi

La crescita su MSA aveva il più alto valore predittivo negativo (NPV) seguito da DNasi, mentre la coagulasi tubulare aveva il più basso NPV (che non corrispondeva all’alta sensibilità inizialmente osservata, vedere tabella 3). Al contrario, le combinazioni di test hanno dato NPV assoluti (100%) ad eccezione di DNasi/MSA (NPV del 92%), tabella 3., Gli elevati NPV delle combinazioni di test, in particolare quelli che coinvolgono il TCT, rivelano che le combinazioni di test possono essere utilizzate in modo affidabile nell’identificazione di routine di Staphylococcus aureus. DNase ha avuto il più alto valore predittivo positivo (PPV), seguito da MSA (96% e 83%, rispettivamente). Viceversa, la coagulasi tubulare da sola ha prodotto PPV medi (54% e 50%), vedere tabella 3. È interessante notare che le combinazioni di test hanno portato a PPV elevati, con quelli che coinvolgono DNasi che hanno i PPV più alti (95%), vedere tabella 3., Pertanto, come per gli NPV, la specificità del TCT può essere migliorata mediante un’identificazione simultanea degli isolati con DNasi e MSA.

Pertanto, l’identificazione ideale degli isolati clinici di Staphylococcus aureus richiede una batteria di test. Le infezioni da Staphylococcus aureus sono più frequenti di quelle di altri batteri, in particolare in ambienti con elevata prevalenza di HIV / AIDS . Ciò garantisce una corretta identificazione degli isolati per ottenere migliori risultati di trattamento., Poiché vengono presentate opzioni per migliorare la sensibilità e la specificità, questi dati miglioreranno l’identificazione dell’aureo stafilococcico nei campioni clinici.

Raccomandazioni

Per l’identificazione di routine di Staphylococcus aureus da campioni clinici, si consiglia l’uso simultaneo di tutti e tre i test (a partire dalla crescita su MSA, DNasi e coagulasi del tubo) in ambienti in cui i plasmi di coniglio o cavallo non sono facilmente disponibili., Si raccomanda lo screening di plasmi provenienti da altre specie (come coniglio, capra, maiale e bovino), che possono essere più economici e sicuri e segnalati come più efficienti del plasma umano con TCT. Inoltre, si raccomanda la genotipizzazione di isolati stafilococcici clinici per specicare gli isolati CoNS e per determinare la prevalenza di rari Staphylococcus aureus e isolati animali in esemplari umani in Uganda.