Le connessioni genetiche tra percorsi di riparazione del DNA e predisposizione al cancro umano hanno alimentato l’interesse per le proteine che riconoscono e riparano siti specifici di danno al DNA. Gli enzimi di riparazione sono notevolmente conservati dai batteri ai funghi agli esseri umani, sottolineando il premio posto sul mantenimento dell’integrità genomica di fronte a un carico mutageno., Il DNA è suscettibile di danni causati da errori commessi durante la replicazione e da fattori ambientali, come radiazioni, ossidanti o agenti alchilanti. Le reazioni della riparazione comprendono l’escissione delle basi chimicamente alterate o mispaired dal duplex del DNA. Le lacune risultanti sono riempite dentro dalle polimerasi del DNA; questa reazione lascia un nick a o che fiancheggia il luogo di riparazione. Un processo analogo si verifica durante la replicazione del DNA cromosomico, per cui i segmenti 5 ‘ – RNA che innescano la sintesi discontinua dei frammenti di Okazaki vengono asportati e le lacune intervenienti vengono riempite dalla DNA polimerasi.,

I percorsi di riparazione e replicazione del DNA convergono su un passaggio finale comune in cui la continuità del filamento di DNA riparato viene ripristinata dalla DNA ligasi, un enzima che converte le scalfitture in legami fosfodiesterici. Le scalfitture sono lesioni del DNA potenzialmente deleterie che, se non corrette, possono dar luogo a rotture letali a doppio filamento. Di conseguenza, la perdita totale della funzione della ligasi del DNA è letale.

Reazione della DNA Ligasi

Le DNA ligasi catalizzano l’unione di un filamento terminato con 5’fosfati ad un filamento terminato con 3’-idrossile., La legatura dipende dal magnesio e da un cofattore ad alta energia, ATP o NAD+. Il meccanismo di reazione coinvolge 3 reazioni sequenziali di trasferimento nucleotidilico. Nella prima fase, attacchi nucleofili su alfa-fosforo di ATP (adenosina trifosfato) o NAD+ (nicotinamide adenina dinucleotide) da ligasi risultati nel rilascio di pirofosfato o accoppiati nmn (nicotinamide mononucleotide) e la formazione di un intermedio covalente (ligasi-adenilato) in cui l’AMPLIFICATORE è collegato tramite un phosphoamide (P-N) legame con il gruppo amminico epsilon di lisina., Nella seconda fase, l’AMP viene trasferito al 5’-fine del 5 ‘ -fosfato-terminato filamento di DNA per formare DNA-adenilato-una struttura a ponte pirofosfato invertito, AppN. In questa reazione, l’ossigeno 5 ‘ – fosfato del filamento di DNA attacca il fosforo della ligasi-adenilato; la catena laterale della lisina del sito attivo è il gruppo uscente. Nella terza fase, la ligasi catalizza l’attacco del 3 ‘ – OH del nick sul DNA-adenilato per unirsi ai 2 polinucleotidi e liberare l’AMP.

Distribuzione filogenetica

Gli organismi viventi comprendono 3 domini: eubatteri, archeabatteri ed eucarioti., Tutti gli organismi codificano 1 o più DNA ligasi. Le ligasi sono raggruppate in 2 famiglie, ligasi ATP-dipendenti e ligasi NAD + – dipendenti, secondo il substrato nucleotidico richiesto per la formazione di ligasi-adenilato. Le ligasi del DNA ATP-dipendenti si trovano in tutti e 3 i domini. Le ligasi del DNA NAD + – dipendenti (LigA) sono onnipresenti nei batteri, dove sono essenziali per la crescita e presentano obiettivi attraenti per la scoperta di farmaci anti-infettivi. Le ligasi NAD + – dipendenti si incontrano solo sporadicamente al di fuori del dominio batterico della vita, ad es.,, in archaea halophilic ed in determinati virus del DNA e presumibilmente sono stati acquisiti in questi taxa dal trasferimento orizzontale del gene.

Le ligasi ATP-dipendenti cellulari eucariotiche

Le ligasi del DNA ATP-dipendenti si trovano in tutte le specie eucariotiche. Le cellule di mammifero contengono quattro isozimi della DNA ligasi. I confronti tra amminoacido e sequenza suggeriscono che un dominio catalitico di base comune a tutte le ligasi ATP-dipendenti è impreziosito da ulteriori domini specifici dell’isozima situati ai termini amminici o carbossilici delle proteine., Si pensa che questi segmenti fiancheggianti mediano il legame delle ligasi del DNA dei mammiferi ad altre proteine coinvolte nella replicazione, riparazione e ricombinazione del DNA. Gli isozimi dei mammiferi sono indicati come ligasi I, ligasi IIIa, ligasi IIIb e ligasi IV. La DNA ligasi I è un polipeptide di 919 aminoacidi, espresso in tutti i tessuti, che catalizza l’unione di frammenti di Okazaki durante la replicazione del DNA e svolge anche un ruolo nella riparazione del DNA., Le DNA ligasi IIIa (922 amminoacidi) e IIIb (862 amminoacidi) sono i prodotti di un singolo gene; differiscono nella sequenza aminoacidica solo ai loro termini carbossilici come conseguenza dello splicing alternativo dell’mRNA. La ligasi IIIa è espressa ubiquitamente ed è implicata nella riparazione del DNA ed è essenziale per la funzione mitocondriale. L’espressione della ligasi IIIb è limitata al testicolo, in particolare agli spermatociti sottoposti a meiosi. DNA ligasi IV è un polipeptide 911-aminoacido che svolge un ruolo nella riparazione delle rotture di DNA a doppio filamento tramite giunzione non omologa (NHEJ).,

Le cellule di lievito contengono 2 ligasi di DNA codificate separatamente, che sono omologhe alle ligasi I e IV del DNA dei mammiferi, rispettivamente. La DNA ligasi I (Cdc9p) del lievito in erba Saccharomyces cerevisiae è essenziale per la crescita cellulare. Gli esperimenti genetici implicano la ligasi I nel sigillare frammenti di Okazaki e nel completamento della riparazione dell’escissione del DNA. Al contrario, il lievito DNA ligasi IV non è essenziale per la crescita cellulare. Tuttavia, la delezione del gene LIG4 suscita i fenotipi che indicano che la ligasi IV catalizza la riparazione delle rotture del doppio filamento nell’estremità non omologa che unisce la via (NHEJ)., Il lievito in erba non ha un apparente omologo della DNA ligasi III dei mammiferi.

Ligasi virali del DNA ATP-dipendenti

I virus del DNA batterico, come i batteriofagi di E. coli T4, T6, T7 e T3, codificano le proprie ligasi del DNA ATP-dipendenti. Le ligasi del DNA ATP-dipendenti sono anche codificate da virus del DNA eucariotico che conducono parte o tutto il loro ciclo di replicazione nel citoplasma. Questi includono il virus della vaccinia, il virus della peste suina africana e il virus della clorella PBCV1. I batteriofagi e le ligasi del DNA virale eucariotico sono più piccoli delle loro controparti cellulari., Vaccinia DNA ligasi, 552-amino acido polipeptide, è sorprendentemente simile alla sequenza di aminoacidi a livello dei mammiferi, DNA ligasi III. Infatti, ligasi III è più strettamente correlata con vaccinia ligasi rispetto ai mammiferi ligasi I e IV. La ligasi T4 (487 aminoacidi), T7 (359 aminoacidi), T3 (346 aminoacidi), e Clorella virus (298 amminoacidi) sono ancora più piccolo. Abbiamo dimostrato che la Clorella virus ligasi può integrare la crescita di un ceppo di lievito in cui il gene DNA ligasi I è stato eliminato., Questo risultato suggerisce che i segmenti proteici unici per la molto più grande DNA ligasi I non sono essenziali per la crescita delle cellule di lievito.

Nick-Sensing by DNA Ligases

Abbiamo esaminato l’interazione delle ligasi eucariotiche con il DNA utilizzando enzimi codificati da virus come modelli. La DNA ligasi del virus di Vaccinia e la DNA ligasi del virus della clorella formano ciascuno un complesso discreto con un ligando singolarmente intaccato del DNA in assenza di magnesio che può essere risolto dal DNA libero tramite elettroforesi nativa del gel della poliacrilammide., Virale ligasi non formare complessi stabili con il seguente ligandi: (i) di DNA contenente un 1-nucleotide o 2-nucleotide gap; (ii) la sigillato duplex di DNA prodotto della reazione di legatura; (iii) un singolarmente scalfito duplex contenente 5’-OH capolinea presso il nick invece di un 5’-fosfato; o (iv) un singolarmente scalfito duplex contenente un filamento di RNA sul 5’-fosfato lato del nick (da 10 a 15). Pertanto, le ligasi virali del DNA ATP-dipendenti hanno una funzione intrinseca di nick-sensing.,

Nick riconoscimento da vaccinia DNA ligasi e Clorella virus DNA ligasi dipende anche dalla capienza dell’AMP tasca di legame sull’enzima — cioè, le mutazioni della ligasi sito attivo che abolire la capacità di formare la ligasi-adenilato intermedio anche eliminare il nick di riconoscimento; considerando che una mutazione che conserva ligasi-adenilato ma inattiva fasi a valle del lamento di entrare reazione ha alcun effetto sull’associazione a scalfito DNA., Il sequestro di un nucleotide extraelicale mediante ligasi legata al DNA ricorda il meccanismo “base-flipping” del riconoscimento e della catalisi del sito bersaglio utilizzato da altri enzimi di modifica e riparazione del DNA.

Sebbene la frazione 5’-fosfato sia essenziale per il legame della ligasi del virus della clorella al DNA scalfito, la frazione 3’-OH non è necessaria per il riconoscimento del nick. La ligasi del virus della clorella lega ad un legante intaccato che contiene 2’, 3 ‘dideossi e 5’ termini del fosfato ma non può catalizzare l’adenilazione dell’estremità 5’., Pertanto, il 3 ‘ – OH è importante per la chimica del passo 2 anche se non è esso stesso trasformato chimicamente durante la formazione di DNA-adenilato.

Per delineare l’interfaccia ligasi-DNA, abbiamo impresso il sito di legame della ligasi sul DNA. La dimensione dell’impronta dell’esonucleasi III della ligasi legata a un singolo nick nel DNA duplex è da 19 a 21 nucleotidi. L’impronta è asimmetrica, estendendo da 8 a 9 nucleotidi sul lato 3 ‘ – OH del nick e da 11 a 12 nucleotidi sul lato 5’-fosfato.,

Struttura cristallina della ligasi-adenilato del DNA eucariotico

La DNA ligasi del virus della clorella (ChVLig) è la più piccola ligasi eucariota ATP-dipendente nota. Come la ligasi “minima” del DNA, ha presentato un obiettivo attraente per la determinazione della struttura. Abbiamo cristallizzato ChVLig e determinato la sua struttura a 2 Å risoluzione. L’enzima è costituito da un dominio N-terminale nucleotidiltransferasi (NTasi) più grande e un dominio OB C-terminale più piccolo con una fessura tra di loro. Una frazione AMP era legata covalentemente alla Nz di Lys27 nel sito attivo., Quindi, abbiamo la struttura di un vero intermedio catalitico.

All’interno del dominio NTasi è una tasca di legame adenilato composta dai sei motivi peptidici (I, Ia, III, IIIa, IV e V) che definiscono la superfamiglia degli enzimi nucleotidiltransferasi covalente che include DNA e RNA ligasi e enzimi di capping dell’mRNA. Motivo I (KxDGxR) contiene la lisina a cui AMP diventa legato covalentemente nella prima fase della reazione ligasi. Gli amminoacidi nei motivi Ia, III, IIIa, IV e V contattano l’AMPLIFICATORE e svolgono ruoli essenziali in uno o più passaggi del percorso di legatura., Il dominio OB è costituito da un barile beta antiparallelo a cinque fili più un’elica alfa.

Base strutturale per il riconoscimento Nick da un minimo “pluripotente” DNA ligasi

Anche se ChVLig manca il grande N – o C-terminale che fiancheggiano domini trovati in eucarioti DNA ligasi cellulari, può sostenere la crescita mitotica, riparazione del DNA, e fine nonhomologous unendo in lievito in erba quando è l’unica fonte di ligasi nella cellula. ChVLig può anche svolgere le funzioni essenziali del Lig3 mammifero nel metabolismo del DNA mitocondriale., Abbiamo proposto che ChVLig rappresenti una ligasi “pluripotente” ridotta a causa della sua intrinseca funzione di nick sensing, la cui base è stata illuminata quando abbiamo risolto la struttura cristallina di 2,3 Å di ChVLig-AMP legata a un nick 3’-OH/5’-PO4 nel DNA duplex.

ChVLig circonda il DNA come un morsetto proteico a forma di C. Il dominio NTase si lega ai filamenti di DNA rotti e intatti nella scanalatura principale che fiancheggia il nick e anche nella scanalatura minore sul lato 3 ‘ – OH del nick. Il dominio OB si lega attraverso la scanalatura minore sulla faccia del duplex dietro il nick., Un nuovo modulo “latch” -costituito da un loop beta – tornante che emana dal dominio OB-occupa la scanalatura principale e completa il morsetto circonferenziale tramite contatti tra la punta del loop e la superficie del dominio NTase. Il fermo è fondamentale per la chiusura del morsetto ed è un fattore determinante del nick sensing.

Confronto delle strutture cristalline del libero e nick-bound ChVLig-AMP rivela un ampio dominio riarrangiamenti che accompagnano il riconoscimento nick., Nel ChVLig-AMP libero, il dominio OB viene riflesso lontano dal dominio NTase per esporre completamente la superficie di legame del DNA sopra la tasca di legame dell’AMP. Il segmento peptidico destinato a diventare il latch è disordinato nella ligasi libera e sensibile alla proteolisi. Ma questo segmento è protetto dalla proteolisi quando ChVLig si lega al DNA scalfito. Il legame del DNA comporta una rotazione quasi 180 del dominio OB attorno a una rotazione, in modo che la superficie concava del barile beta OB si inserisca nella scanalatura minore del DNA., Questa transizione provoca un movimento di 63 Å del dominio OB e posiziona il fermo in profondità nella scanalatura principale del DNA.

Una rete di interazioni con i termini 3’-OH e 5’-PO4 nel sito attivo ha illuminato il meccanismo di adenililazione del DNA e i ruoli critici dell’AMP nel nick-sensing e nella catalisi. L’aggiunta di un catione bivalente ha innescato la sigillatura nick in crystallo, stabilendo così che il complesso nick è un intermedio in buona fede nella via di riparazione del DNA.,

Struttura della ligasi del DNA NAD+-dipendente legata al DNA-adenilato intaccato

Le ligasi del DNA NAD+-dipendente (denominate LigA) sono un clade distintivo e strutturalmente omogeneo di enzimi presenti in tutti i batteri. E. coli LigA (671-aa) è il prototipo di questa famiglia. LigA ha un’architettura modulare costruita attorno a un nucleo centrale ligase composto da un dominio NTase e un dominio OB. Il nucleo è affiancato da un dominio “Ia” N-terminale e tre moduli C-terminale: un dito di zinco tetracisteina, un dominio helix-hairpin-helix (HhH) e un dominio BRCT., Ogni fase del percorso di legatura dipende da un sottoinsieme diverso dei domini LigA, con solo il dominio NTase richiesto per tutti i passaggi. Il dominio Ia è unico per le ligasi NAD + – dipendenti, è responsabile del legame della frazione NMN di NAD+ ed è necessario per la reazione con NAD + per formare l’intermedio ligasi-AMP.

Abbiamo scoperto che la NAD+-dipendente E. coli DNA ligasi in grado di supportare la crescita di Saccharomyces cerevisiae ceppi eliminati singolarmente per CDC9 o doppiamente per CDC9 più LIG4., Questa è la prima dimostrazione che un enzima NAD+-dipendente è biologicamente attivo in un organismo eucariotico. Studi successivi (in collaborazione con Maria Jasin) hanno dimostrato che E. coli LigA potrebbe essere sufficiente per la funzione della ligasi nelle cellule ES di topo prive dell’enzima Lig3 essenziale.

La nostra struttura cristallina di E. coli LigA legata all’intermedio DNA-adenilato scalfito ha rivelato che LigA circonda anche l’elica del DNA come un morsetto proteico a forma di C. L’interfaccia proteina-DNA comporta estesi contatti di DNA da parte dei domini NTase, OB e HhH su un segmento di 19 bp di DNA duplex centrato sul nick., Il dominio NTase si lega ai filamenti di DNA spezzati e fiancheggiano il nick, il dominio OB contatta il filamento continuo del modello che circonda il nick e il dominio HhH lega entrambi i fili attraverso la scanalatura minore alla periferia dell’impronta. Il modulo Zn-finger svolge un ruolo strutturale nel colmare i domini OB e HhH. Il dominio Ia non ha contatti con il duplex del DNA, coerente con la sua dispensabilità per la catalisi della chiusura del filamento su un substrato di AppDNA.,

I domini LigA NTase e OB sono posizionati in modo simile sulla circonferenza del DNA rispetto ai domini NTase e OB delle ligasi del DNA ATP-dipendenti e “ormeggiano” segmenti simili dei filamenti di DNA. Tuttavia la topologia del morsetto LigA è nettamente diversa dai morsetti formati da ChVLig e DNA umano ligasi 1 (HuLig1, determinato da Tom Ellenberger e colleghi). I contatti kissing che chiudono il morsetto LigA sono sui generis, coinvolgendo il dominio NTase e il dominio HhH C-terminal., Sulla base dei dati strutturali disponibili, è chiaro che le ligasi del DNA hanno evoluto almeno tre diversi mezzi di circondare il DNA.

I confronti del complesso di E. coli LigA—AppDNA con strutture di altre ligasi batteriche catturate come il complesso binario LigA•—NAD+ (substrato di fase 1), il complesso binario LigA•—NMN (il gruppo di uscita post-fase 1) e l’intermedio covalente ligasi-AMP (prodotto step1 dopo la dissociazione del gruppo) evidenziano massicci riarrangiamenti del dominio proteico (dell’ordine di 50-90 Å) che si verificano in sincronia con il legame al substrato e la catalisi., Legame del DNA e la formazione morsetto da LigA comporta un quasi 180 rotazione del dominio OB in modo che la superficie concava del barile beta OB si inserisce nella scanalatura minore, simile a ciò che si vede o dedotto per ChVLig e HuLig1. Il legame a quattro punti del dominio HhH alla periferia dell’impronta del LigA-DNA stabilizza una curva del DNA centrata sul nick. Le interazioni LigA-DNA che fiancheggiano immediatamente il nick inducono una distorsione locale del DNA, con conseguente adozione di un’elica A forma di RNA, riecheggiando nuovamente i risultati per il cocrystal HuLig1-DNA.,

Meccanismo di adenililazione della lisina da parte delle ligasi polinucleotidiche ATP-dipendenti e NAD+-dipendenti

La reazione di auto-adenililazione delle ligasi polinucleotidiche viene eseguita da un dominio nucleotidiltransferasi (NTasi) conservato nelle ligasi del DNA e dell’RNA ATP-dipendenti e nelle ligasi del DNA NAD+-dipendenti. Il dominio NTase include la definizione di motivi peptidici che formano la tasca di legame nucleotidico. Il motivo I (KxDG) contiene la lisina che si lega covalentemente all’AMPLIFICATORE. Come ha sottolineato Robert Lehman nel 1974, non è chiaro come la lisina (con un valore pKa previsto di ~10.,5) perde il suo protone a pH fisiologico per raggiungere lo stato non protonato richiesto per l’attacco al fosforo α di ATP o NAD+. In linea di principio, la ligasi potrebbe impiegare una base generale per deprotonare la lisina. In alternativa, il pKa potrebbe essere guidato dal potenziale di carica positiva degli amminoacidi proteici che circondano la lisina-Nz. Diverse strutture cristalline di ligasi metalli assenti fornito scarso supporto per entrambe le spiegazioni. In queste strutture, il nucleofilo di lisina motif I si trova accanto a una catena laterale di glutammato o aspartato motif IV., La lisina e il motivo IV carbossilato formano una coppia ionica, il cui effetto previsto è quello di aumentare il pKa della lisina in virtù della carica negativa circostante. È improbabile che un anione glutammato o aspartato possa servire come base generale per astrarre un protone dal catione lisina. Una potenziale soluzione al problema sarebbe se un catione bivalente confina con la lisina-Nz e spinge verso il basso il suo pKa.,

Un meccanismo guidato dal metallo è stato rivelato dalla nostra recente struttura cristallina della Naegleria gruberi RNA ligasi (NgrRnl) come un complesso di Michaelis step 1 con ATP e manganese (il suo cofattore metallico preferito). La chiave per catturare il complesso simile a Michaelis era la sostituzione del nucleofilo di lisina con una metionina isosterica. La struttura di 1,9 Å conteneva ATP e due ioni manganese nel sito attivo. Il metallo “catalitico” era coordinato con geometria ottaedrica a cinque acque, che erano a loro volta coordinate dalle catene laterali carbossilate dei residui conservati nei motivi I, III e IV., Il sesto sito di ligando nel complesso metallico catalitico era occupato da un ATP α fosfato di ossigeno, indicativo di un ruolo per il metallo nella stabilizzazione dello stato di transizione della reazione di auto-adenililazione. Un’intuizione chiave, fortificata dalla sovrapposizione del complesso di Michaelis sulla struttura dell’intermedio covalente NgrRnl-(Lys-Nz)–AMP, riguardava il ruolo del complesso metallico catalitico nella stabilizzazione dello stato non protonato del nucleofilo della lisina prima della catalisi, tramite carica positiva locale e contatto atomico di Lys-Nz a una delle acque legate al metallo., Il complesso NgrRnl Michaelis ha rivelato un secondo metallo, coordinato ottaedralmente a quattro acque e agli ossigeni di ATP β e γ fosfato. Il complesso metallico e l’ATP γ fosfato sono stati impegnati da un insieme di catene laterali aminoacidiche (uniche per NgrRnl) che orientano collettivamente il PPi lasciando il gruppo apicale al nucleofilo della lisina. Coerentemente con un meccanismo in linea a singolo stadio, l’α fosfato è stato invertito stereochimicamente durante la transizione dal complesso NgrRnl•ATP Michaelis all’intermedio lysyl-AMP.,

Si pensa che le DNA ligasi si siano evolute separatamente dalle RNA ligasi, inizialmente per fusione di un dominio ntasi ancestrale che utilizza ATP in un dominio OB C-terminale (per comprendere il nucleo catalitico minimo di una DNA ligasi), e successivamente tramite la fusione di moduli strutturali aggiuntivi al nucleo NTasi-OB (7). Le ligasi del DNA NAD + – dipendenti (enzimi LigA), che sono onnipresenti nei batteri ed essenziali per la vitalità batterica, hanno acquisito la loro specificità per NAD+ tramite la fusione di un modulo di dominio Ia NMN-binding all’N-terminale del dominio NTasi., Escherichia coli DNA ligasi (EcoLigA) è stato il primo DNA ligasi cellulare scoperto e caratterizzato e rimane il modello principale per gli studi strutturali e funzionali della famiglia NAD+-dipendente DNA ligasi. L’interesse per il meccanismo LigA è spinto dalla promessa di targeting LigA (tramite la sua firma NAD+ specificità del substrato e caratteristiche strutturali uniche rispetto alle ligasi del DNA umano) per la scoperta di farmaci antibatterici.

Abbiamo risolto una struttura cristallina di 1,55 Å di EcoLigA come complesso di Michaelis con NAD+ e magnesio., La struttura rivela un meccanismo di un metallo in cui un complesso Mg2+(H2O)5 legato alla ligasi abbassa la lisina pKa e impegna il fosfato α NAD+, ma il fosfato β e il nucleoside nicotinammide del gruppo di partenza NMN sono orientati esclusivamente tramite interazioni atomiche con elementi proteici unici per il clade LigA. La dicotomia a due metalli (per la ligasi ATP-dipendente) rispetto a quella a un metallo (per la ligasi NAD+-dipendente) delimita un punto di branchpoint nell’evoluzione della ligasi.