Progettazione del percorso sintetico acetil-CoA

Il modo più semplice per sintetizzare il carbonio organico da un carbonio è costruirlo uno per uno., Per costruire una via artificiale acetil-CoA da un carbonio, abbiamo proposto la via sintetica Acetil-CoA (SACA), dove due molecole di formaldeide sarebbero trasferite in una molecola di acetil-CoA attraverso solo tre passaggi (Fig. 1 bis). In primo luogo, la formaldeide sarebbe condensata in glicolaldeide (GALD) dalla glicolaldeide sintasi (GALS). E poi la glicolaldeide sarebbe convertita in acetil-fosfato (AcP) dall’acetil-fosfato sintasi (ACPS) usando fosfato inorganico. Infine, AcP sarebbe utilizzato per produrre acetil-CoA dal noto enzima fosfato acetiltransferasi (PTA)25., Nel frattempo, la formaldeide può essere ottenuta riducendo l’anidride carbonica e formate26 o ossidando metano e metanol27. Quindi, potremmo realizzare la biosintesi dell’acetil-CoA dalla formaldeide e persino da altre risorse di carbonio.

La termodinamica può riflettere se un percorso potrebbe essere condotta efficacemente in vivo o in vitro. Abbiamo calcolato la forza motrice chimica termodinamica del percorso SACA progettato., La reazione complessiva dalla formaldeide all’acetil-CoA è altamente termodinamicamente favorevole, dove il cambiamento totale di energia di Gibbs (ΔRG’m) dell’intera reazione è di circa -96,7 kJ mol−1 (Fig. 1b e Tabella supplementare 1). Il valore di MDF (maximum driving force) viene solitamente utilizzato per valutare la qualità termodinamica e cinetica dei diversi percorsi.28 Se l’MDF è sufficientemente alto, il percorso non contiene colli di bottiglia termodinamici che ostacolerebbero il suo funzionamento in vivo. La via SACA ha ottenuto il valore MDF relativamente alto di 26.,9 kJ mol-1, che è ovviamente superiore ai percorsi FLS e MCC (i loro valori MDF sono 1.9 e 5.8 kJ mol−1, rispettivamente). Pertanto, la via SACA è termodinamicamente favorevole per la biosintesi dell’acetil-CoA dalla formaldeide.

Identificazione di un nuovo enzima da C1 a C2

La condensazione della formaldeide può essere catalizzata dalla carabina N-eterociclica in chimica29,30. In biologia, l’anello di tiazolio del cofattore tiamina difosfato (ThDP) ha una funzione simile, che potrebbe attivare un’aldeide e quindi formare un dimero con un’altra aldeida31., Per trovare un enzima per condensare due molecole di formaldeide in una molecola di glicolaldeide, ci siamo riferiti ai meccanismi catalitici degli enzimi dipendenti dal ThDP e abbiamo costruito un modello di teozima, che include ThDP, glicolaldeide e acido glutammico che fornisce elettrone per la reazione32 (Fig. 2 bis). Tutti gli enzimi in Protein Data Bank (PDB)sono stati virtualmente sottoposti a screening sulla base del modello theozyme e sono state raggiunte 37 strutture proteiche non ridondanti con ligando ThDP (Fig. 1 e Nota integrativa)., Secondo i meccanismi catalitici degli enzimi dipendenti da thdp33, 34, 35, l’atomo C2 in ThDP è il centro attivo. La distanza tra l’atomo di C2 e il prodotto della glicolaldeide è fondamentale per innescare la reazione catalitica (Fig. 2 bis). Pertanto, abbiamo analizzato la distanza tra atomo C2 e glicolaldeide in ciascuna proteina candidata.

In base alle distanze medie di ciascuna proteina mediante docking molecolare (Dati supplementari 1)36, sono stati definiti candidati sei candidati con brevi distanze e chiare annotazioni funzionali (Fig. 2b e Tabella supplementare 2). Inoltre, tre proteine con lunghe distanze sono state scelte a caso come controlli. I candidati e i controlli sono stati espressi e purificati per testare la loro capacità di produrre glicolaldeide dalla formaldeide., Tre su sei candidati esibivano l’attività desiderata, mentre tre controlli non avevano la funzione, indicando che la distanza tra l’atomo di C2 e la glicolaldeide svolge un ruolo critico sulla condensazione della formaldeide. Tra i tre candidati attivi, la proteina 2UZ1 (https://www.rcsb.org/structure/2UZ1) che è stata definita benzaldeide liasi (BAL), è stata segnalata per generare preferenzialmente diidrossiacetone (DHA) nonostante la resa minima di glicolaldeide quando la concentrazione di formaldeide era più bassa37., The other two proteins 3FZN (https://www.rcsb.org/structure/3FZN) and 4K9Q (https://www.rcsb.org/structure/4K9Q) that produce glycolaldehyde from formaldehyde were named as benzoylformate decarboxylases (BFD) in PDB database. And BFD (3FZN) from Pseudomonas putida was selected as candidate for subsequent modification since it has higher activity and expression level (Fig. 2c).,

Evoluzione diretta della glicolaldeide sintasi

Poiché BAL era stato progettato per produrre DHA da formaldehyde22, abbiamo proposto di rilevare se le corrispondenti mutazioni in BFD contribuirebbero anche a migliorare l’attività enzimatica (Fig. 2). Esaminando tutti i residui mutati, abbiamo infatti trovato una mutazione altamente attiva W86R-N87T che si trovava nel canale del substrato di BFD (Fig. 3). Così questa mutazione (W86R-N87T) è stata introdotta in BFD e la variante è stata contrassegnata come M1., Al fine di migliorare ulteriormente l’attività catalitica di BFD, abbiamo proposto di schermare tutti i residui attorno al centro attivo di BFD, dove sono state selezionate 25 posizioni entro 8 Å di distanza dal centro attivo per eseguire la mutagenesi di saturazione a punto singolo (Fig. 4). Abbiamo sviluppato un approccio di screening ad alto rendimento per rilevare la glicolaldeide mediante reazione a colori tra glicolaldeide e difenilammina, che è stata misurata mediante monitor spettrofotometrico a 650 nm (Fig. 5)., Dopo lo screening, abbiamo scoperto che 14 posizioni su 25 mostravano attività più elevate rispetto al mutante M1 (Fig. 6). Successivamente, 14 posizioni sono state divise in 8 gruppi: A (N27/G402), B (N27/S236), C (N27/A460), D (F397/C398), E (L109/L110), F (H281/Q282), G (N374/S378) e H (T379/T380). N27 è stato utilizzato tre volte poiché le varianti in questa posizione mostravano l’attività più alta. Usando M1 come modello, abbiamo introdotto ogni gruppo di mutazioni in M1 e selezionato il mutante attivo più alto, che è stato etichettato come M2., Eseguendo tre cicli di mutagenesi combinatoria iterativa tra queste posizioni, abbiamo totalmente proiettato 64.512 cloni e ottenuto un mutante ad alta attività che contiene cinque nuove mutazioni attorno al centro attivo. Infine, la variante con mutazioni di residui 7 è stata denominata glicolaldeide sintasi (GALS). Il kcat di GALS è stato migliorato di circa 160 volte e l’efficienza catalitica finale di GALS è di 9,6 M·1 * s−1, che è circa 70 volte rispetto all’enzima di partenza (Fig. 3a e ulteriori Fig. 7).

Per capire come queste mutazioni migliorano l’attività enzimatica, abbiamo proposto di rifare la cristallizzazione delle RAGAZZE. La tasca attiva individua all’interfaccia di omodimero di GALS38., La struttura proteica delle RAGAZZE può differire dalla proteina di partenza dopo diversi cicli di mutazione. Qui, abbiamo cristallizzato la proteina di GALS e recuperato la struttura cristallina di GALS usando la struttura di BFD come modello di ricerca (Tabella supplementare 3). È stata analizzata la struttura cristallina delle RAGAZZE (Fig. 8, Fig.supplementare. 9). Abbiamo scoperto che la mutazione di L110E introduce due ulteriori legami idrogeno al gruppo idrossilico dell’analogo intermedio (IMA), che possono contribuire a stabilizzare lo stato di transizione e a scindere il legame C–C tra prodotto e cofattore ThDP (Fig. 3 ter)., La mutazione di L109G ha ingrandito il volume della tasca di legame del substrato sostituendo il grande gruppo isobutilico con un gruppo idrogeno. La terza mutazione di A460M può riorientare il substrato e quindi migliorare l’interazione tra ThDP e substrato. Le ultime due mutazioni H281V e Q282F hanno ampliato il raggio dei pori della superficie esterna e possono facilitare l’accesso al substrato o al prodotto (Fig. 3 quater). Confrontando con M1, il volume della tasca di reazione nelle RAGAZZE è stato ingrandito di oltre il 30%, il che sarebbe la ragione principale per il miglioramento dell’attività catalitica.,

Identificazione dell’acetil-fosfato sintasi

In natura, non è stato segnalato alcun enzima per ottenere la sintesi di AcP dalla glicolaldeide. Le fosfoketolasi (PKs) possono produrre AcP da fruttosio-6-fosfato (F6P) o xilulosio-5-fosfato (X5P)39. Secondo il meccanismo catalitico di PKs, è possibile che la glicolaldeide interagisca con ThDP e quindi generi 2-α, β-diidrossietilidene-ThDP (DHEThDP) (Fig. 4a), che è l’intermedio chiave per formare AcP da F6P o X5P da PKS. Per confermare la nostra ipotesi, abbiamo selezionato otto candidati (Fig., 4b) basato sull’albero filogenetico di PKs da 111 famiglie di batteri (Fig. 10). Dopo sintesi genica e purificazione proteica (Fig. 11), abbiamo esaminato l’attività catalitica di tutte le proteine candidate utilizzando la glicolaldeide come substrato. Fortunatamente, cinque su otto PK hanno mostrato attività catalitiche significative. Solo PK1, PK4 e PK8 non hanno mostrato differenze significative rispetto al controllo vuoto. Pertanto, PK2 con la più alta attività è stato definito come acetil-fosfato sintasi (ACPS), il cui kcat/Km raggiunge 3,21 M−1·s−1 (Fig. 12).,

Per rivelare il meccanismo di formazione di DHEThDP dalla glicolaldeide, abbiamo proposto di eseguire analisi teoriche basate sul precedente modello computazionale di PK40. Tutti gli amminoacidi possibili relativi alla formazione di DHEThDP sono stati usati per costruire il modello computazionale (Fig. 13)., Sulla base della simulazione computazionale, abbiamo scoperto che la barriera energetica è solo 11,36 kcal mol−1 per la formazione di IM1 (intermedio 1) quando la glicolaldeide è stata protonata da His553, che è stato considerato come il più possibile proton donor40 (Fig. 4 quater). Quindi, IM1 tautomerizes in IM2 con l’assistenza di Glu479 e Glu437. IM2 è energeticamente più stabile di IM1. Quando il protone di IM2 è stato rimosso da N4 ‘ in ThDP, la barriera di energia da IM2 al DHEThDP intermedio chiave è 15.,13 kcal mol−1, che è simile all’energia di deformazione durante la formazione di DHEThDP usando F6P come substrate40. Dopo la formazione di DHEThDP, i seguenti processi catalitici sono gli stessi di altri PK (Fig. 14), cioè, H97 agisce come donatore di protoni del processo di disidratazione di DHEThDP, e His142 e Gly155 accelerano il processo di disidratazione di DHEThDP, a giudicare dal fatto che His142 e Gly155 formano legami idrogeno con la molecola d’acqua nella struttura dell’intermedio post-disidratazione (AcThDP)., His64, Tyr501 e Asn549 sono importanti per l’attacco nucleofilo da parte di Pi e insieme formano il sito di legame di Pi39. Esperimenti di mutagenesi diretti al sito hanno anche indicato che questi residui sono fondamentali per l’attività enzimatica (Fig. 15).

Sintesi di acetil-CoA dalla formaldeide in vitro

Con il progetto iniziale di successo di GALS e ACP, abbiamo inteso costruire il percorso SACA in vitro per sintetizzare acetil-CoA dalla formaldeide. In primo luogo, abbiamo misurato la resa di glicolaldeide da GALS sotto diverse concentrazioni di formaldeide., I risultati hanno mostrato che le RAGAZZE possono catalizzare efficacemente la dimerizzazione della formaldeide e la resa della glicolaldeide è aumentata con la concentrazione del substrato migliorata (Fig. 5 bis). Ad esempio, la resa di glicolaldeide dalla formaldeide è aumentata dal 45% a 0,5 g L−1 all ‘ 80% a 2 g L−1. In secondo luogo, abbiamo esaminato l’efficienza catalitica dalla glicolaldeide all’AcP, che è stata quantificata dal contenuto di acido acetico poiché l’AcP sarebbe stato rapidamente degradato in acido acetico (Fig. 16)23., I risultati hanno mostrato che la resa di AcP ha raggiunto oltre l ‘ 80% in diverse concentrazioni di glicolaldeide tramite ACPS (Fig. 17). Purtroppo, ACPS è stato ovviamente inibito dalla formaldeide (Fig. 5 ter). Pertanto, è necessario prendere un equilibrio per la concentrazione di formaldeide nella risoluzione di questo conflitto.

Al fine di ottimizzare la concentrazione di formaldeide, è stato eseguito un esperimento di gradiente utilizzando il sistema di reazione che contiene 2 mg mL−1 di GALS e ACP. Con l’aumentare della concentrazione di formaldeide, la resa di acido acetico nel sistema inizialmente aumentava e poi diminuiva (Fig. 5 quater). Quando la concentrazione di formaldeide è 1 g L-1, la resa di acido acetico ha raggiunto il 50,6%., È interessante notare che la resa finale dell’acido acetico è addirittura superiore a quella nel sistema di reazione dalla glicolaldeide all’AcP con la stessa quantità di formaldeide(Fig. 5b, linea grigia). Ciò sarebbe causato dal rilascio parziale della funzione degli ACP poiché la formaldeide veniva gradualmente consumata dalle RAGAZZE. Sulla base di questo sistema, abbiamo ulteriormente aggiunto un altro noto enzima fosfato acetiltransferasi (PTA), che convertirebbe AcP in acetil-CoA. Infine, la via SACA ha prodotto 5,5 mm di acetil-CoA alla concentrazione di formaldeide di 1 g L-1. La resa di acetil-CoA dalla formaldeide era di circa il 33% (Fig. 5d)., Tuttavia, la resa di acido acetico (7,8 mm) dalla formaldeide (33,3 mm) ha raggiunto il 50% se non sono stati forniti PTA e CoA. La minore resa di acetil-CoA rispetto a quella dell’acido acetico sarebbe causata dall’instabilità di acetil-CoA e AcP. I nostri risultati hanno indicato che è successo per la biosintesi di acetil-CoA dalla formaldeide tramite la via SACA in vitro.,

Validazione della via SACA mediante etichettatura 13C

Dopo aver accertato la via SACA con enzimi purificati in vitro, abbiamo ulteriormente tentato di testare la biosintesi dell’acetil-CoA e dei suoi derivati dalla via SACA in vivo mediante saggi traccianti metabolici 13C (Fig. 6 bis). In primo luogo, i lisati cellulari sono stati utilizzati per verificare la biosintesi dell’acetil-CoA mediante l’aggiunta di formaldeide e CoA marcati con 13C. Abbiamo rilevato un aumento significativo del doppio acetil-CoA marcato con 13C rispetto ad altri controlli (P-value < 0.001, T-test) (Fig. 6b e Fig. 18)., Inoltre, l’aumento del doppio acetil-CoA marcato con 13C è scomparso se abbiamo omesso uno dei geni nella via SACA come ACPS e PTA (Fig. 19). Inoltre, l’acetil-CoA sarebbe convergente con l’ossaloacetato per entrare nel ciclo dell’acido tricarbossilico (TCA). Abbiamo anche rilevato significativamente più doppio fumarato marcato con 13C (P-value <0.001, T-test) e malato (P-value < 0.001, T-test) solo nel ceppo con la via SACA e l’alimentazione di formaldeide marcata con 13C (Fig. 6b e Fig. 18)., Tuttavia, non abbiamo rilevato differenze significative negli isotopomeri di massa di ordine superiore. Sarebbe causato dalla bassa quantità di doppi isotopomeri marcati con 13C nel ciclo TCA.

Successivamente, abbiamo proposto di testare il flusso di carbonio all’interno delle celle. A causa della tossicità della formaldeide per le cellule, abbiamo introdotto la metanolo deidrogenasi da Bacillus stearothermophilus (BsMDH)41 per mantenere una concentrazione continuamente bassa di formaldeide in vivo (Fig. 6 bis). Le cellule coltivate sono state raccolte in diversi punti temporali e sono state utilizzate per rilevare aminoacidi proteogenici e metaboliti intracellulari (Fig. 6 quater)., Abbiamo scoperto che il ceppo con la via SACA (BsMDH-SACA) conteneva più aspartato e glutammato etichettati con 13C, derivati dal ciclo TCA. Inoltre, il glucosio marcato con 13C e il fosfoenolpiruvato, che potrebbero generare da doppio ossaloacetato marcato con 13C attraverso la via della gluconeogenesi, sono stati rilevati più nel ceppo BsMDH-SACA rispetto a quelli nel ceppo di controllo (BsMDH-28a). Pertanto i nostri risultati hanno indicato che la via SACA è funzionale alla produzione di metaboliti derivati da acetil-CoA e acetil-CoA dalla formaldeide.,

Valutazione della via SACA per crescita cellulare

Al fine di valutare ulteriormente la via SACA in vivo, abbiamo proposto di testare la crescita cellulare gradualmente alimentando ciascun intermedio nella via. Inizialmente E. coli è cresciuto sotto il mezzo ricco e quindi la glicolaldeide è stata aggiunta come fonte di carbonio supplementare. Aggiungendo diverse concentrazioni di glicolaldeide (Fig. 20), abbiamo scoperto che il ceppo ingegnerizzato che contiene la via SACA con più di 0.,4 g L-1 fornitura di glicolaldeide ha notevole OD600 superiore a quelli ceppi senza glicolaldeide o la via SACA (Fig. 7a e Fig. 21). Il contributo della glicolaldeide alla biomassa (peso secco cellulare, CDW) è stato di 0,681 ± 0,028 gCDWg−1 (n = 3) glicolaldeide.

Quando abbiamo testato la crescita cellulare utilizzando la formaldeide come fonte di carbonio supplementare, la crescita del ceppo con vettore vuoto è stata totalmente inibita da 80 mg L−1 di formaldeide (Fig. 7 ter). Il ceppo contenente la via SACA è stato inizialmente inibito e poi è cresciuto normalmente nella stessa condizione, che può essere causata dal suo tasso più veloce di consumo di formaldeide rispetto al ceppo con vettore vuoto (Fig. 22)., Sfortunatamente il ceppo contenente la via SACA non aveva più biomassa con supplemento di formaldeide rispetto a quelli senza formaldeide. Questi risultati hanno indicato che sebbene la via SACA sia più efficiente per rimuovere la formaldeide tossica, non è sufficiente fornire biomassa.

Alla fine, abbiamo inteso valutare la via SACA alimentando il metanolo, che sarebbe stato continuamente convertito in formaldeide. Abbiamo scoperto che il ceppo contenente sia la via BsMDH che la via SACA ha un OD600 superiore rispetto a quei controlli senza fornitura di metanolo o la via SACA (Fig. 7c e supplementari Fig., 23). Dopo 26 ore di incubazione, abbiamo scoperto che il valore di OD600 nel ceppo contenente sia la via BsMDH che la via SACA aumentava di circa 0,2, che è significativamente più alto del ceppo senza la via SACA (P-value = 0,005, T-test). Confrontando con il ceppo senza la via SACA, abbiamo scoperto che la quantità di biomassa derivata dal metanolo era 0,03 ± 0,006 gCDW g−1 (n = 3) metanolo nel ceppo che contiene la via SACA.