Fattori di trascrizione generali e inizio della trascrizione da RNA polimerasi II
Poiché l’RNA polimerasi II è responsabile della sintesi di mRNA da geni codificanti proteine, è stato al centro della maggior parte degli studi di trascrizione negli eucarioti. I primi tentativi di studiare questo enzima hanno indicato che la sua attività è diversa da quella della RNA polimerasi procariotica., La trascrizione accurata dei geni batterici che può essere realizzata in vitro semplicemente con l’aggiunta di RNA polimerasi purificata al DNA contenente un promotore non è possibile nei sistemi eucariotici. La base di questa differenza fu chiarita nel 1979, quando Robert Roeder ei suoi colleghi scoprirono che l’RNA polimerasi II è in grado di iniziare la trascrizione solo se vengono aggiunte ulteriori proteine alla reazione. Pertanto, la trascrizione nel sistema eucariotico sembrava richiedere fattori di iniziazione distinti che (a differenza dei fattori σ batterici) non erano associati alla polimerasi.,
Il frazionamento biochimico degli estratti nucleari ha ora portato all’identificazione di proteine specifiche (chiamate fattori di trascrizione) che sono necessarie per l’RNA polimerasi II per avviare la trascrizione. In effetti, l’identificazione e la caratterizzazione di questi fattori rappresenta una parte importante degli sforzi in corso per comprendere la trascrizione nelle cellule eucariotiche. Sono stati definiti due tipi generali di fattori di trascrizione. I fattori di trascrizione generali sono coinvolti nella trascrizione da tutti i promotori della polimerasi II e quindi costituiscono parte del meccanismo di trascrizione di base., Ulteriori fattori di trascrizione (discussi più avanti nel capitolo) si legano alle sequenze di DNA che controllano l’espressione dei singoli geni e sono quindi responsabili della regolazione dell’espressione genica.
Cinque fattori di trascrizione generali sono necessari per iniziare la trascrizione da RNA polimerasi II in sistemi ricostituiti in vitro (Figura 6.12). I promotori di molti geni trascritti dalla polimerasi II contengono una sequenza simile a TATAA da 25 a 30 nucleotidi a monte del sito di inizio trascrizione., Questa sequenza (chiamata TATA box) assomiglia all’elemento di sequenza -10 dei promotori batterici e i risultati dell’introduzione di mutazioni nelle sequenze TATAA hanno dimostrato il loro ruolo nell’inizio della trascrizione. Il primo passo nella formazione di un complesso di trascrizione è il legame di un fattore di trascrizione generale chiamato TFIID alla scatola TATA (TF indica il fattore di trascrizione; II indica la polimerasi II)., TFIID è di per sé composto da più subunità, tra cui la TATA-binding protein (TBP), che si lega specificamente alla sequenza di consenso TATAA, e 10-12 altri polipeptidi, chiamati TBP-associated factors (TAFs). TBP lega quindi un secondo fattore di trascrizione generale (TFIIB) formando un complesso TBP-TFIIB presso il promotore (Figura 6.13). TFIIB a sua volta serve da ponte alla RNA polimerasi, che si lega al complesso TBP-TFIIB in associazione con un terzo fattore, TFIIF.
Figura 6.12
Formazione di un complesso di trascrizione della polimerasi II., Molti promotori della polimerasi II hanno una scatola di TATA (sequenza di consenso TATAA) da 25 a 30 nucleotidi a monte del sito di inizio della trascrizione. Questa sequenza è riconosciuta dal fattore di trascrizione TFIID, che (più…)
Figura 6.13
Modello del complesso TBP-TFIIB legato al DNA. Il DNA è mostrato come una figura stilizzata composta da fili gialli e verdi, con il sito di iniziazione della trascrizione designato + 1. TBP consiste di due ripetizioni, colorate blu chiaro e blu scuro. TFIIB ripete (più…,)
In seguito al reclutamento di RNA polimerasi II al promotore, è necessario il legame di due fattori aggiuntivi (TFIIE e TFIIH) per l’inizio della trascrizione. TFIIH è un fattore multisubunità che sembra svolgere almeno due ruoli importanti. In primo luogo, due subunità di TFIIH sono elicasi, che possono svolgere DNA intorno al sito di iniziazione. (Queste subunità di TFIIH sono anche necessarie per la riparazione dell’escissione nucleotidica, come discusso nel capitolo 5.,) Un’altra subunità di TFIIH è una proteina chinasi che fosforila sequenze ripetute presenti nel dominio C-terminale della più grande subunità della RNA polimerasi II. La fosforilazione di queste sequenze è pensato per rilasciare la polimerasi dalla sua associazione con l’iniziazione complesso, consentendo di procedere lungo il modello di come si allunga il crescente RNA a catena.
Oltre a una scatola TATA, i promotori di molti geni trascritti dalla RNA polimerasi II contengono un secondo importante elemento di sequenza (un iniziatore, o Inr, sequenza) che attraversa il sito di inizio della trascrizione., Inoltre, alcuni promotori della RNA polimerasi II contengono solo un elemento Inr, senza scatola TATA. L’iniziazione a questi promotori richiede ancora TFIID (e TBP), anche se TBP ovviamente non riconosce questi promotori legandosi direttamente alla sequenza TATA. Invece, altre subunità di TFIID (TAFs) sembrano legarsi alle sequenze Inr. Questo legame recluta TBP al promotore e TFIIB, polimerasi II e ulteriori fattori di trascrizione si assemblano come già descritto. TBP svolge quindi un ruolo centrale nell’avvio della trascrizione della polimerasi II, anche su promotori che mancano di una scatola TATA.,
Nonostante lo sviluppo di sistemi in vitro e la caratterizzazione di diversi fattori di trascrizione generali, molto resta da imparare riguardo al meccanismo della trascrizione della polimerasi II nelle cellule eucariotiche. Il reclutamento sequenziale dei fattori di trascrizione qui descritti rappresenta il sistema minimo richiesto per la trascrizione in vitro; possono essere necessari ulteriori fattori all’interno della cellula. Inoltre, l’RNA polimerasi II sembra essere in grado di associarsi ad alcuni fattori di trascrizione in vivo prima dell’assemblaggio di un complesso di trascrizione sul DNA., In particolare, complessi preformati di RNA polimerasi II con TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH e altre proteine regolatrici trascrizionali sono stati rilevati sia nel lievito che nelle cellule di mammifero. Questi grandi complessi (chiamati oloenzimi della polimerasi II) possono essere reclutati in un promotore tramite interazione diretta con TFIID (Figura 6.14). I contributi relativi dell’assemblaggio graduale di singoli fattori rispetto al reclutamento dell’oloenzima RNA polimerasi II ai promotori all’interno della cellula rimangono quindi da determinare.
Figura 6.,14
RNA polimerasi II oloenzima. L’oloenzima è costituito da un complesso preformato di RNA polimerasi II, i fattori di trascrizione generali TFIIB, TFIIE, TFIIF e TFIIH e diverse altre proteine che attivano la trascrizione. Questo complesso può essere reclutato (altro…)