Antisettici
Durante la prima guerra mondiale, Fleming con Leonard Colebrook e Sir Almroth Wright si unì agli sforzi bellici e praticamente trasferì l’intero reparto di inoculazione di St Mary’s all’ospedale militare britannico di Boulogne-sur-Mer. Servendo come tenente temporaneo del Corpo medico dell’esercito reale, assistette alla morte di molti soldati per sepsi derivante da ferite infette. Gli antisettici, che erano usati all’epoca per trattare le ferite infette, osservò, spesso peggioravano le lesioni., In un articolo pubblicato sulla rivista medica The Lancet nel 1917, descrisse un ingegnoso esperimento, che fu in grado di condurre a seguito delle sue abilità di soffiatura del vetro, in cui spiegò perché gli antisettici stavano uccidendo più soldati dell’infezione stessa durante la guerra., Gli antisettici funzionavano bene in superficie, ma le ferite profonde tendevano a proteggere i batteri anaerobici dall’agente antisettico, e gli antisettici sembravano rimuovere gli agenti benefici prodotti che proteggevano i pazienti in questi casi almeno così come rimuovevano i batteri e non facevano nulla per rimuovere i batteri che erano fuori dalla portata. Wright sostenne fortemente le scoperte di Fleming, ma nonostante ciò, la maggior parte dei medici dell’esercito nel corso della guerra continuò a usare antisettici anche nei casi in cui ciò peggiorava le condizioni dei pazienti.,
Scoperta del lisozima
Al St Mary’s Hospital, Fleming ha continuato le sue indagini sulla coltura batterica e sulle sostanze antibatteriche. Come ha ricordato il suo studioso di ricerca all’epoca V. D. Allison, Fleming non era un ricercatore ordinato e di solito si aspettava insolite crescite batteriche nelle sue placche di coltura. Fleming aveva preso in giro Allison della sua “eccessiva pulizia in laboratorio”, e Allison giustamente attribuiva tale disordine come il successo degli esperimenti di Fleming, e disse: “era stato ordinato come pensava che fossi, non avrebbe fatto le sue due grandi scoperte.,”
Alla fine del 1921, mentre stava mantenendo le piastre di agar per i batteri, scoprì che una delle piastre era contaminata da batteri dall’aria. Quando ha aggiunto muco nasale, ha scoperto che il muco inibiva la crescita batterica. Circondando l’area del muco c’era un cerchio trasparente chiaro (1 cm dal muco), che indicava la zona di uccisione dei batteri, seguito da un anello vetroso e traslucido oltre il quale c’era un’area opaca che indicava una normale crescita batterica. Nel test successivo, ha usato batteri mantenuti in soluzione salina che formavano una sospensione gialla., Entro due minuti dall’aggiunta di muco fresco, la soluzione salina gialla divenne completamente chiara. Ha esteso i suoi test usando le lacrime, che sono state fornite dai suoi collaboratori. Come ricordò Allison, dicendo: “Per le prossime cinque o sei settimane, le nostre lacrime furono la fonte di approvvigionamento per questo straordinario fenomeno. Molti erano i limoni che abbiamo usato (dopo il fallimento delle cipolle) per produrre un flusso di lacrime… La richiesta di lacrime da parte nostra era così grande, che gli assistenti di laboratorio venivano messi in servizio, ricevendo tre pence per ogni contributo.,”
I suoi ulteriori test con espettorato, cartilagine, sangue, sperma, liquido cisti ovarico, pus e albume hanno mostrato che l’agente battericida era presente in tutti questi. Riferì la sua scoperta prima del Medical Research Club a dicembre e prima della Royal Society l’anno successivo, ma non riuscì a suscitare alcun interesse, come Allison ricordò:
Ero presente a questo incontro come ospite di Fleming. Il suo documento che descrive la sua scoperta è stato ricevuto senza domande e senza discussione, il che era molto insolito e un’indicazione che era considerato di nessuna importanza., L’anno seguente lesse un articolo sull’argomento davanti alla Royal Society, Burlington House, Piccadilly e io e lui abbiamo dato una dimostrazione del nostro lavoro. Anche in questo caso con una sola eccezione piccolo commento o attenzione è stata prestata ad esso.,
Creazione del 1 ° Maggio 1922 numero dei Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, sotto il titolo “una notevole bacteriolytic elemento trovato nei tessuti e secrezioni,” Fleming ha scritto:
In questo tipo di comunicazione, desidero richiamare l’attenzione di una sostanza presente nei tessuti e secrezioni del corpo, che è in grado di sciogliere rapidamente alcuni batteri. Poiché questa sostanza ha proprietà simili a quelle dei fermenti, l’ho chiamata “Lisozima” e si riferirà ad essa con questo nome in tutta la comunicazione., Il lisozima è stato notato per la prima volta durante alcune indagini effettuate su un paziente affetto da corizza acuta.
Questa è stata la prima scoperta registrata del lisozima. Con Allison, ha pubblicato ulteriori studi sul lisozima nel numero di ottobre del British Journal of Experimental Pathology dello stesso anno. Sebbene fosse in grado di ottenere grandi quantità di lisozima dagli albumi, l’enzima era efficace solo contro piccoli conteggi di batteri innocui e quindi aveva poco potenziale terapeutico., Questo indica una delle principali differenze tra batteri patogeni e innocui. Descritto nella pubblicazione originale,” un paziente affetto da corizza acuta ” è stato successivamente identificato come Fleming stesso. Il suo quaderno di ricerca datato 21 November 1921 mostrava uno schizzo della piastra di coltura con una piccola nota: “Coccus Staphyloid from A. F.’s nose.”Ha anche identificato il batterio presente nel muco nasale come Micrococcus Lysodeikticus, dando il nome della specie (che significa “indicatore di lisi” per la sua suscettibilità all’attività lisozimale). La specie è stata riassegnata come Micrococcus luteus nel 1972., Il “ceppo Fleming” (NCTC2665) di questo batterio è diventato un modello in diversi studi biologici. L’importanza del lisozima non è stata riconosciuta, e Fleming era ben consapevole di questo, nel suo discorso Presidenziale alla Royal Society of Medicine riunione del 18 ottobre 1932, ha detto:
scegliere il lisozima come soggetto per questo indirizzo, per due motivi, primo perché ho un paterno interesse nel nome, e, in secondo luogo, perché la sua importanza in relazione con l’immunità naturale non sembrano essere generalmente apprezzato.,
Nella sua conferenza Nobel dell ‘ 11 dicembre 1945 menzionò brevemente il lisozima, dicendo: “La penicillina non fu il primo antibiotico che mi capitò di scoprire.”Fu solo verso la fine del 20 ° secolo che la vera importanza della scoperta di Fleming in immunologia fu realizzata poiché il lisozima divenne la prima proteina antimicrobica scoperta che costituisce parte della nostra immunità innata.,
Scoperta della penicillina
Una pubblicità pubblicitaria della penicillina “cura miracolosa”.
A volte si trova ciò che non si sta cercando. Quando mi svegliai subito dopo l’alba del 28 settembre 1928, di certo non avevo intenzione di rivoluzionare tutta la medicina scoprendo il primo antibiotico al mondo, o batterio killer. Ma suppongo che sia stato esattamente quello che ho fatto.,
— Alexander Fleming
Esperimento
Nel 1927, Fleming aveva studiato le proprietà degli stafilococchi. Era già ben noto dal suo lavoro precedente, e aveva sviluppato una reputazione come un brillante ricercatore. Nel 1928, ha studiato la variazione di Staphylococcus aureus cresciuto in condizioni naturali, dopo il lavoro di Joseph Warwick Bigger, che ha scoperto che il batterio potrebbe crescere in una varietà di tipi (ceppi). Il 3 settembre 1928, Fleming tornò al suo laboratorio dopo aver trascorso una vacanza con la sua famiglia a Suffolk., Prima di partire per le sue vacanze, ha inoculato gli stafilococchi su piastre di coltura e li ha lasciati su una panchina in un angolo del suo laboratorio. Al suo ritorno, Fleming notò che una coltura era contaminata da un fungo e che le colonie di stafilococchi immediatamente circostanti il fungo erano state distrutte, mentre altre colonie di stafilococchi più lontane erano normali, notando notoriamente “Che è divertente”. Fleming mostrò la cultura contaminata al suo ex assistente Merlin Pryce, che gli ricordò: “È così che hai scoperto il lisozima.”Ha identificato lo stampo come appartenente al genere Penicillium., Sospettava che fosse P. chrysogenum, ma un collega Charles J. La Touche lo identificò come P. rubrum. (È stato successivamente corretto come P. notatum e poi ufficialmente accettato come P. chrysogenum; ma alla fine nel 2011, è stato risolto come P. rubens.)
Il laboratorio in cui Fleming scoprì e testò la penicillina è conservato come Alexander Fleming Laboratory Museum nel St. Mary’s Hospital, Paddington. La fonte del contaminante fungino è stata stabilita nel 1966 come proveniente dalla stanza di La Touche, che era direttamente sotto quella di Fleming.,
Fleming coltivò la muffa in una coltura pura e scoprì che il brodo di coltura conteneva una sostanza antibatterica. Ha studiato il suo effetto anti-batterico su molti organismi e ha notato che ha colpito batteri come gli stafilococchi e molti altri patogeni Gram-positivi che causano la scarlattina, la polmonite, la meningite e la difterite, ma non la febbre tifoide o la febbre paratifo, che sono causati da batteri Gram-negativi, per i quali stava cercando una cura al momento. Ha anche colpito Neisseria gonorrhoeae, che causa gonorrea, sebbene questo batterio sia Gram-negativo., Dopo alcuni mesi di chiamarlo “succo di muffa” o “l’inibitore”, diede il nome di penicillina il 7 marzo 1929 per la sostanza antibatterica presente nello stampo.
Ricezione e pubblicazione
Fleming presentò la sua scoperta il 13 febbraio 1929 davanti al Medical Research Club. Il suo discorso su “Un mezzo per l’isolamento del bacillo di Pfeiffer” non ha ricevuto particolare attenzione o commento., Henry Dale, l’allora direttore dell’Istituto Nazionale per la ricerca medica e presidente della riunione, molto più tardi ricordò che egli non ha nemmeno senso alcun punto di notevole importanza nel discorso di Fleming. Fleming pubblicò la sua scoperta nel 1929 sul British Journal of Experimental Pathology, ma fu prestata poca attenzione all’articolo. Il suo problema era la difficoltà di produrre penicillina in grandi quantità e, inoltre, l’isolamento del composto principale., Anche con l’aiuto di Harold Raistrick e del suo team di biochimici della London School of Hygiene and Tropical Medicine, la purificazione chimica era inutile. “Di conseguenza, la penicillina languiva in gran parte dimenticata negli anni ’30”, come ha descritto Milton Wainwright.
Fino al 1936, non c’era apprezzamento per la penicillina. Quando Fleming parlò della sua importanza medica al Secondo Congresso Internazionale di Microbiologia tenutosi a Londra, nessuno gli credette., Come Allison, il suo compagno sia nel Medical Research Club che nella riunione del congresso internazionale, ha osservato le due occasioni:
ha suggerito il possibile valore della penicillina per il trattamento dell’infezione nell’uomo. Ancora una volta c’era una totale mancanza di interesse e nessuna discussione. Fleming era profondamente deluso, ma peggio doveva seguire. Ha letto un articolo sul suo lavoro sulla penicillina in una riunione del Congresso Internazionale di Microbiologia, a cui hanno partecipato i più importanti batteriologi di tutto il mondo., Non c’era alcun sostegno per le sue opinioni sul suo possibile valore futuro per la prevenzione e il trattamento delle infezioni umane e la discussione è stata minima. Fleming sopportò queste delusioni stoicamente, ma non alterarono le sue opinioni o lo dissuadettero dal continuare la sua indagine sulla penicillina.
Nel 1941, il British Medical Journal riportò che ” non sembra essere stato considerato possibilmente utile da nessun altro punto di vista.,”
Purificazione e stabilizzazione
3D-model of benzylpenicillin
A Oxford, Ernst Boris Chain e Edward Abraham stavano studiando la struttura molecolare dell’antibiotico. Abraham fu il primo a proporre la corretta struttura della penicillina. Poco dopo che la squadra pubblicò i suoi primi risultati nel 1940, Fleming telefonò a Howard Florey, capo del dipartimento di Chain, per dire che sarebbe stato in visita nei prossimi giorni. Quando Chain sentì che Fleming stava arrivando, osservò ” Buon Dio! Pensavo fosse morto.,”
Norman Heatley suggerì di trasferire il principio attivo della penicillina in acqua cambiando la sua acidità. Questo ha prodotto abbastanza del farmaco per iniziare i test sugli animali. C’erano molte più persone coinvolte nel team di Oxford, e ad un certo punto l’intera Sir William Dunn School of Pathology fu coinvolta nella sua produzione. Dopo che il team aveva sviluppato un metodo per purificare la penicillina in una prima forma stabile efficace nel 1940, seguirono diversi studi clinici e il loro incredibile successo ispirò il team a sviluppare metodi per la produzione di massa e la distribuzione di massa nel 1945.,
Fleming era modesto riguardo alla sua parte nello sviluppo della penicillina, descrivendo la sua fama come il” Mito Fleming ” e lodò Florey e Chain per aver trasformato la curiosità del laboratorio in un farmaco pratico. Fleming fu il primo a scoprire le proprietà del principio attivo, dandogli il privilegio di nominarlo: penicillina. Ha anche mantenuto, cresciuto, e distribuito lo stampo originale per dodici anni, e ha continuato fino al 1940 per cercare di ottenere aiuto da qualsiasi chimico che aveva abbastanza abilità per fare la penicillina., Ma Sir Henry Harris disse nel 1998: “Senza Fleming, nessuna catena; senza Catena, nessun Florey; senza Florey, nessun Heatley; senza Heatley, nessuna penicillina.”La scoperta della penicillina e il suo successivo sviluppo come farmaco da prescrizione segnano l’inizio dei moderni antibiotici.
Uso medico e produzione di massa
Nel suo primo studio clinico, Fleming ha trattato il suo studioso di ricerca Stuart Craddock che aveva sviluppato una grave infezione dell’antro nasale (sinusite). Il trattamento iniziò il 9 gennaio 1929 ma senza alcun effetto., Probabilmente era dovuto al fatto che l’infezione era con il bacillo influenzale (Haemophilus influenzae), il batterio che aveva trovato insensibile alla penicillina. Fleming diede alcuni dei suoi campioni originali di penicillina al suo collega chirurgo Arthur Dickson Wright per test clinici nel 1928. Sebbene Wright abbia riferito che “sembrava funzionare in modo soddisfacente”, non ci sono registrazioni del suo uso specifico. Cecil George Paine, patologo presso la Royal Infirmary di Sheffield ed ex studente di Fleming, fu il primo a usare la penicillina con successo per il trattamento medico., Curò le infezioni oculari (congiuntivite) di un adulto e tre neonati (congiuntivite neonatale) il 25 novembre 1930.
Fleming ha anche trattato con successo la congiuntivite grave nel 1932. Keith Bernard Rogers, che si era unito a St Mary’s come studente di medicina nel 1929, era il capitano della squadra di fucili dell’Università di Londra e stava per partecipare alla competizione di tiro con il fucile interospedaliero quando sviluppò la congiuntivite. Fleming applicò la sua penicillina e curò Rogers prima della competizione. Si dice che la ” penicillina ha funzionato e la partita è stata vinta.,”Tuttavia, il rapporto che “Keith è stato probabilmente il primo paziente ad essere trattato clinicamente con unguento alla penicillina” non è più vero come le cartelle cliniche di Paine sono apparse.
C’è un’affermazione popolare sia nella letteratura popolare che scientifica secondo cui Fleming abbandonò in gran parte il lavoro sulla penicillina nei primi anni 1930. Nella sua recensione di The Life of Sir Alexander Fleming di André Maurois, Scopritore della penicillina, William L. Kissick arrivò al punto di dire che “Fleming aveva abbandonato la penicillina nel 1932…, Anche se il destinatario di molti onori e l’autore di molto lavoro scientifico, Sir Alexander Fleming non sembra essere un soggetto ideale per una biografia.”Questa è una falsa informazione, poiché Fleming ha continuato a perseguire la ricerca sulla penicillina. Già nel 1939, il quaderno di Fleming mostra i tentativi di rendere migliore la produzione di penicillina utilizzando diversi media. Nel 1941 pubblicò un metodo per la valutazione dell’efficacia della penicillina., Per quanto riguarda l’isolamento chimico e la purificazione, Howard Florey e Ernst Boris Chain presso la Radcliffe Infirmary di Oxford hanno intrapreso la ricerca per produrlo in serie, e realizzato con il supporto di progetti militari della seconda guerra mondiale sotto i governi statunitense e britannico.
A metà del 1942, il team di Oxford produsse il composto di penicillina pura come polvere gialla. Nell’agosto del 1942, Harry Lambert (un socio del fratello di Fleming, Robert) fu ricoverato al St Mary’s Hospital a causa di un’infezione pericolosa per la vita del sistema nervoso (meningite streptococcica)., Fleming lo trattò con sulfonamidi, ma le condizioni di Lambert peggiorarono. Ha testato la suscettibilità agli antibiotici e ha scoperto che la sua penicillina potrebbe uccidere i batteri. Ha chiesto a Florey il campione isolato. Quando Florey ha inviato il campione non completamente purificato, che Fleming ha immediatamente somministrato nel canale spinale di Lambert. Lambert ha mostrato segni di miglioramento il giorno successivo, e completamente recuperato entro una settimana. Fleming pubblicò il caso clinico su The Lancet nel 1943.,
Su questa svolta medica, Allison ha informato il Ministero della Salute britannico dell’importanza della penicillina e della necessità di una produzione di massa. Il Gabinetto di guerra era convinto dell’utilità su cui Sir Cecil Weir, direttore generale delle attrezzature, ha chiesto una riunione sul modo di agire il 28 settembre 1942. Il Comitato della penicillina è stato creato il 5 aprile 1943. Il comitato era composto da Weir come presidente, Fleming, Florey, Sir Percival Hartley, Allison e rappresentanti delle aziende farmaceutiche come membri., Gli obiettivi principali erano di produrre rapidamente penicillina in grandi quantità con la collaborazione di aziende americane e di fornire il farmaco esclusivamente per le forze armate alleate. Dal D-Day del 1944, era stata prodotta abbastanza penicillina per curare tutti i feriti delle truppe alleate.
Resistenza agli antibiotici
Gli antibiotici moderni vengono testati utilizzando un metodo simile alla scoperta di Fleming.,
Fleming ha anche scoperto molto presto che i batteri sviluppavano resistenza agli antibiotici ogni volta che veniva usata troppa poca penicillina o quando veniva usata per un periodo troppo breve. Almroth Wright aveva predetto la resistenza agli antibiotici ancor prima che fosse notata durante gli esperimenti. Fleming avvertì dell’uso della penicillina nei suoi numerosi discorsi in tutto il mondo. Il 26 giugno 1945 fece le seguenti dichiarazioni cautelari: “i microbi sono educati a resistere alla penicillina e una miriade di organismi veloci con la penicillina viene allevata …, In tali casi la persona sconsiderata che gioca con la penicillina è moralmente responsabile della morte dell’uomo che alla fine soccombe all’infezione con l’organismo resistente alla penicillina. Spero che questo male possa essere evitato.”Ha ammonito di non usare la penicillina a meno che non ci fosse una ragione correttamente diagnosticata per essere usata, e che se fosse usata, non usare mai troppo poco o per un periodo troppo breve, poiché queste sono le circostanze in cui si sviluppa la resistenza batterica agli antibiotici.
Era stato dimostrato sperimentalmente nel 1942 che S., aureus potrebbe sviluppato resistenza alla penicillina sotto esposizione prolungata. Elaborando la possibilità di resistenza alla penicillina in condizioni cliniche nella sua Conferenza Nobel, Fleming ha detto:
Potrebbe arrivare il momento in cui la penicillina può essere acquistata da chiunque nei negozi. Poi c’è il pericolo che l’uomo ignorante può facilmente sottodose se stesso e esponendo i suoi microbi a quantità non letali del farmaco renderli resistenti.
Fu in quel periodo che fu riportato il primo caso clinico di resistenza alla penicillina.