az oxidáz teszt egy citokróm oxidáz rendszer jelenlétét észleli, amely katalizálja az elektronok szállítását a baktériumok elektrondonorai között, valamint egy redox festék – tetrametil-p-fenilén-diamin. A festék mély lila színre csökken., Ezt a vizsgálatot a Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella és Pasteurella azonosítására használják, amelyek mindegyike a citokróm oxidáz enzimet termeli.

a vizsgálathoz számos reagens használható.,

• Kovacs Oxidase Reagent:

1% tetra-methyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water

• Gordon and McLeod’s Reagent:

1% dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water

• Gaby and Hadley (indophenol oxidase) Reagent:

1% α-naphthol in 95% ethanol

1% p-aminodimethylaniline HCL

Principle of Oxidase Test

Cytochrome containing organisms produce an intracellular oxidase enzyme. This oxidase enzyme catalyzes the oxidation of cytochrome c., A légzésláncuk részeként citokróm c-t tartalmazó organizmusok oxidáz-pozitívak, és a reagens kék/lila színűvé válnak. A citokróm C-vel nem rendelkező organizmusok légzési láncuk részeként nem oxidálják a reagenst, így színtelen marad a vizsgálat keretein belül, és oxidáz-negatívak.

az oxidáz-pozitív baktériumok citokróm-oxidázzal vagy indofenol-oxidázzal (haemoproteint tartalmazó vas) rendelkeznek. Mindkettő katalizálja az elektronok donor vegyületekből (NADH) az elektron akceptorokba (általában oxigénbe) történő szállítását., Az N, N, N, N’, N’-tetrametil-p-fenilén-diamin-dihidroklorid teszt reagens az oxidáz enzim mesterséges elektron akceptoraként működik. Az oxidált reagens az indofenol kék színű vegyületet alkotja.

a citokróm rendszer általában csak olyan aerob szervezetekben van jelen, amelyek képesek az oxigént végső hidrogénreceptorként felhasználni. Ennek az anyagcserének a végterméke víz vagy hidrogén-peroxid (katalázzal lebontva).

az oxidáz teszt célja / felhasználása

• az oxidáz teszt annak meghatározására szolgál, hogy egy szervezet rendelkezik-e a citokróm oxidáz enzimmel.,
• a vizsgálatot Neisseria, Moraxella, Campylobacter és Pasteurella Fajok (oxidáz-pozitív) differenciálódásának elősegítésére használják.
• azt is használják, hogy megkülönböztessék pseudomonads rokon fajok.

oxidáz teszt eljárása

az oxidáz teszt számos módszerváltozata létezik. Ezek közé tartozik, de nem kizárólagosan a szűrőpapír-vizsgálat, a közvetlen lemezes módszer, a tampon módszer, az impregnált oxidáz tesztcsík módszer és a kémcső módszer. Minden idő és koncentráció az eredeti ajánlásokon alapul.,

száraz szűrőpapír módszer

mivel az oxidáz reagens instabil, és frissen fel kell készíteni a használatra, ez a módszer kényelmes.

1. az 1. számú szűrőpapír csíkját frissen elkészített 1%-os tertrametil-p-fenilén-diamin-dihidroklorid oldatban áztatjuk.
2. körülbelül 30 másodpercig tartó leürítés után a csíkokat fagyasztva szárítjuk, és egy csavaros kupakkal szorosan lezárt sötét üvegben tároljuk.
3. használat céljából egy csíkot eltávolítunk, petri edénybe tesszük, desztillált vízzel megnedvesítjük.,
4. a vizsgálandó kolóniát platina hurokkal veszik fel,majd a nedves területre kenik.
5. a pozitív reakciót 5-10 másodpercen belül megjelenő intenzív, mély lila színárnyalat, 10-60 másodpercen belül színezéssel “késleltetett pozitív” reakció, valamint 60 másodpercen belül színezés vagy színezés hiányában bekövetkező negatív reakció jelzi.

nedves szűrőpapír módszer

1. egy szűrőpapírcsíkot áztatunk a reagens egy kis frissen készített 1% – os oldatával.
2. a kultúra egy foltját platina hurokkal dörzsöljük rá.,
3. a pozitív reakciót 5-10 másodpercen belül megjelenő intenzív, mély lila színárnyalat, 10-60 másodpercen belül színezéssel “késleltetett pozitív” reakció, valamint 60 másodpercen belül színezés vagy színezés hiányában bekövetkező negatív reakció jelzi.

Direct Plate Method

1. adjon hozzá 2 -3 csepp reagenst közvetlenül az agar lemezen lévő gyanús telepekhez. Ne öntse el a lemezt a reagenssel.
2. figyelje meg a színváltozást 10 másodpercen belül.

Megjegyzés: A közvetlen lemez módszerét nem szelektív agar lemezen kell elvégezni.,

1. Kovac oxidáz reagensének használatakor a mikroorganizmusok oxidáz-pozitívak, ha a szín 5-10 másodpercen belül sötét lilára változik. A mikroorganizmusok késleltetik az oxidáz pozitív, ha a szín 60-90 másodpercen belül lilára változik. A mikroorganizmusok oxidáz-negatívak, ha a szín nem változik, vagy 2 percnél hosszabb ideig tart.
2. Gordon és McLeod reagens használatakor a mikroorganizmusok oxidáz-pozitívak, ha a szín 10-30 percen belül pirosra vagy 60 percen belül feketére változik. A mikroorganizmusok oxidáz-negatívak, ha a szín nem változik.,

tampon módszer

1. Dip tampont reagensbe, majd érintse meg az izolált gyanús kolóniát
2. figyelje meg a színváltozást 10 másodpercen belül.

kémcsöves módszer

1. 4, 5 ml tápközegben (vagy olyan tápközegben, amely nem tartalmaz nagy koncentrációjú cukrot) friss baktériumkultúrát (18-24 óra).
2. adjunk hozzá 0,2 ml 1% α-naftolt, majd adjunk hozzá 0,3 ml 1% p-amino-dimetil-anilin-oxalátot (Gaby és Hadley reagensek).
3. rázza erősen a tenyészet keveredésének és alapos oxigénellátásának biztosítása érdekében.,
4. figyelje meg a színváltozásokat.
5. a mikroorganizmusok oxidáz-pozitívak, ha a szín kékre változik 15-30 másodpercen belül. A mikroorganizmusok késleltetik az oxidáz pozitív hatását, amikor a szín 2-3 percen belül lilára változik. A mikroorganizmusok oxidáz-negatívak, ha a szín nem változik.

az Oxidázteszt

pozitív eredmény

mély lila-kék/kék szín kialakulása 5-10 másodpercen belül oxidáztermelést jelez.

negatív eredmény

nincs lila-kék szín / nincs színváltozás.,

Examples

Oxidase Positive Organisms: Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella, Pasteurella, Moraxella, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, etc.

Oxidase Negative Organisms: Enterobacteriaceae (e.g. E., coli)

Minőség-Ellenőrzés Oxidáz Vizsga

Pozitív Kontroll: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Negatív Kontroll: Escherichia coli ATCC 25922

Korlátai Oxidáz Vizsga

1. A használt reagensek a oxidáz teszt kimutatták, hogy az auto-szórás, ezért nagyon fontos, hogy friss, reagensek, nem volt idősebb, mint 1 hét.
2. mind a magas koncentrációjú glükózt tartalmazó táptalajon termesztett baktériumok, mind az élesztő gátolt oxidáz aktivitást mutatnak, ezért ajánlott a táptalajon termesztett kolóniák tesztelése felesleges cukor, például tápanyag-agar nélkül., A triptikus szója agar szintén kiváló média.
3. a színezékeket tartalmazó táptalajon termesztett baktériumok aberráns eredményeket adhatnak.
4. a vizsgálati reagensek hatékonyan megölik a mikroorganizmusokat, ezért az al-tenyésztést el kell végezni, mielőtt bármilyen reagenst hozzáadnának egy aktív tenyészethez.
5. az oxidázteszt felhasználható a Neisseria feltételezett azonosítására, valamint a gram-negatív bacillusok differenciálására és azonosítására. Az oxidáz-pozitív organizmusokat gram-folttal kell vizsgálni a morfológia és a gram-reakció meghatározása érdekében., A teljes azonosításhoz további biokémiai vizsgálatok ajánlottak.
6. nikróm vagy más vastartalmú hurok használata hamis pozitív reakciókat eredményezhet. Platina hurkok ajánlottak.
7. a legtöbb Haemophilus oxidáz-pozitív. A kevésbé érzékeny csíkok vagy reagensek hamis negatív eredményeket hozhatnak.
8. a gram-negatív bacillusok oxidáz reakcióit nem szelektív és nem differenciált közegeken kell meghatározni az érvényes eredmények biztosítása érdekében. A magas glükózszintet tartalmazó közegből vett kolóniák hamis negatív reakciókat is okozhatnak.,
9. 18-24 órás kolóniák használata ajánlott. Az idősebb kolóniák gyengébb reakciókat váltanak ki.
10. a 20 másodperc után megjelenő színváltozásokat figyelmen kívül kell hagyni.