A következő generációs szekvenálási (NGS) módszerek a 2000-es évek közepén kezdtek megjelenni a szakirodalomban, és átalakító hatással voltak a mikrobiális genomika és a fertőző betegségek megértésére. Mindazonáltal jelentős vita folyik arról, hogy a klinikai diagnosztikai laboratóriumban hogyan, mikor és hol fog szerepet játszani a következő generációs szekvenálás., A Journal of Clinical Microbiology mély merülési pont-ellenpont megbeszélése a metagenomic next generation sequencing (mNGS) rutin laboratóriumokba történő bevezetésével járó kihívásokat és lehetőségeket tárgyalja. Pontosan mi az mNGS és miben különbözik a többi nukleinsav-technológiától?

mi a Metagenomikus következő generációs szekvenálás?

A következő generációs szekvenálás a számos nagy áteresztőképességű szekvenálási módszer közül bármelyik, amelynek során több milliárd nukleinsav fragmens egyszerre és önállóan szekvenálható., Ezzel a technikával ellentétben a klasszikus módszerek, mint a Sanger szekvenálás (más néven dideoxinukleotid lánc végződési szekvenálás), amely feldolgozza egy nukleotid szekvenciát reakciónként.
a bakteriális genom jellemzéséhez például az NGS segítségével a genomot több fragmensre osztják, amelyek szekvenciákat termelnek vagy olvasnak, több száz-tízezer bázisig. A szekvenciákat egyetlen genomba állítják össze számítási megközelítésekkel. Több egymást átfedő szekvencia olvasás vannak összerakva, hogy egyetlen hosszabb szekvencia úgynevezett contig., Gyakran vannak hiányosságok között contigs s bár a high-fidelity hosszabb sorozat olvassa lenne az ideális módszer a szekvenálás, platformok, amelyek rövidebb olvas általában kevésbé költséges, valamint az átfedés a sorozatok teszi őket pontosabb. A felépített Genom (valószínűleg hiányosságokat tartalmaz) egy referencia-adatbázishoz igazodik a szervezet azonosításához. Ez a technológia jelentős előrelépést jelent a szekvenálás korai napjaiban, amikor egyetlen bakteriális genomprojekt több évig is eltarthat.,
Metagenomic NGS (mNGS) egyszerűen fut minden nukleinsav egy mintában, amely tartalmazhat vegyes populációk mikroorganizmusok, és hozzárendelése ezeket a referencia genomok, hogy megértsük, mely mikrobák vannak jelen, és milyen arányban. A képesség, hogy a sorrend, illetve azonosítására nukleinsav több különböző taxonok a metagenomic elemzés teszi ezt a hatalmas, új platform, amely egyszerre azonosítani a genetikai anyagot teljesen más királyságok szervezetekre.,
a lehetséges klinikai alkalmazások hatalmasak, többek között a fertőző betegségek diagnosztizálása, a kitörések nyomon követése, a fertőzés ellenőrzése, valamint a mutáció és a kórokozó felfedezése. mNGS, más néven shotgun szekvenálás, a klinikai minták alkalmazták a különböző minták, beleértve a cerebrospinális folyadék, vér, légzőszervi minták, gyomor-bélrendszeri folyadék, szemfolyadék.

milyen előnyei vannak a Metagenomikus következő generációs szekvenálásnak?,

az mNGS legnagyobb erőssége az, hogy elfogulatlan hipotézismentes diagnosztikai módszer, ellentétben a célzott polimeráz láncreakció (PCR) módszerekkel, amelyek primerekre támaszkodnak az erősítendő és detektálandó konkrét célok azonosítására. Még az egyetemes vagy széles körű PCR módszerek nem kellően tág ahhoz, hogy figyelembe metagenomic, mint használnak specifikus primerekkel a kézirattár 16 ribosomal RNS (rrns) gén belső átírt távtartó (A) szekvenciák, hogy felerősítse jellegzetes nukleinsav-szekvenciák, hogy lehet bioinformatically sorolt baktériumok/archaea képes boldogulni, vagy a gombák esetében.,
Az univerzális alapozók problémát jelentenek a polimikrobiális fertőzések molekuláris tesztekkel történő diagnosztizálásakor is. Ha polimikrobiális populációk vannak jelen a 16S szekvenálás során, nukleotidonként több bázishívás történik, ami vegyes nukleotid kromatogramot eredményez, amelyet nem lehet értelmezni. Bár vannak de-konvolúciós számítási módszerek az azonosított organizmusok előrejelzésére, ezek sok laboratórium esetében nem szokásos használatúak, amelyek gyakran a 16S gén következő generációs szekvenálására reagálnak a polimikrobiális mintákra.,

melyek a Metagenomic következő generációs szekvenálásának kihívásai?

annak ellenére, hogy a potenciális mNGS, sok akadály, hogy egyértelmű, mielőtt a technológia részévé válhat a mainstream laboratórium, valamint a hiányosságok a megértést a diagnosztikai hasznosság. A fő fenntartások közé tartozik az eredmények értelmezése (a szennyeződés és a kolonizáció megkülönböztetése a valódi kórokozóktól), az elemzésekhez használt adatbázisok kiválasztása és validálása, valamint az antimikrobiális érzékenységek előrejelzése (vagy hiánya)., Általános felfogás, hogy az mNGS annyira hihetetlenül érzékeny, hogy felfedi a diagnózist, ha az összes többi vizsgálat negatív. Míg az mNGS bizonyos esetekben analitikailag érzékenyebb lehet a standard tenyésztési módszereknél, a nagy mennyiségű humán nukleinsav szükséges eltávolítása a szekvenálás előkészítése során és (számítási módszerekkel) a posztanalitikai folyamat során csökkentheti az érzékenységet számos szervezet célzott PCR-megközelítéseihez képest.

az mNGS sajátossága továbbra is a közmondásos elefánt a szobában., Szennyeződés a minták alatt példány gyűjtemény egy nagy aggodalomra adnak okot a megnövekedett analitikai érzékenység a mNGS képest standard kultúra módszerek, valamint szükség van egy ellenőrzött minőség-ellenőrzési folyamat hely lépésre értékelése reagens tisztasága mérési megfelelő genom lefedettség irányítja. Ezenkívül néhány Illumina platformon rossz vonalkód-indexeket lehet kijelölni, ami hamis pozitív eredményekhez vezet az adatok szekvenálásakor., Bioinformatikai minőségellenőrzésekre van szükség annak biztosítása érdekében, hogy a kiváló minőségű és validált genomok minimális adatbázis-hibákkal rendelkezésre álljanak, és ideális esetben bioinformatikus személyzet állna rendelkezésre az egyes vizsgálatok szekvenálási eredményeinek értelmezésére, amely a legtöbb klinikai mikrobiológiai laboratóriumban nem áll rendelkezésre., A Federal Drug Administration (FDA) együttműködött más szövetségi ügynökségekkel az FDA-ARGOS (FDA-database for regulatory-grade mikrobiális szekvenciák) nevű adatbázis kurátora érdekében, amely hasznos volt annak biztosítása érdekében, hogy a jelenlegi mNGS eredmények megbízhatóak és pontosak legyenek, de ezeket az erőforrásokat frissíteni kell és fenn kell tartani.
a nagyobb kérdés továbbra is az mNGS klinikai specifikusságát veszi körül: a patogének észlelt szekvenciái hozzájárulnak-e a beteg jelenlegi betegségéhez?, Az analitikai specificitás a mNGS vizsgálat foglalkozott a szigorú ellenőrzések során mintavétel, szekvenálás könyvtár készítmény, assay futni, bioinformatic besorolás, de klinikai sajátossága közvetlenül nem érintették ezek a megközelítések. A klinikai hasznosság és alkalmazhatóság meghatározására szolgáló kérdések a következők: Hogyan különböztethetjük meg a tranziens bakterémiával kapcsolatos organizmusokat a vér/plazma mNGS tesztelésekben az orális/gasztrointesztinális növényektől vagy a bőr kolonizátoroktól?, Hogyan kell jelenteni a szekvenálási mélységet, és mennyire megbízható a szekvenciamélység kapcsolata a valódi fertőzéssel? Ez a kapcsolat kórokozó/gazda szerint különbözik? Mennyi ideig tart a kórokozó várható felezési ideje az mNGS-nél, ha a beteg megfelelő gyógykezelést kap? A klinikai hasznosságról és a költséghatékonyságról szóló tanulmányokra nagy szükség van annak ellenére, hogy ez a technológia kutatási és felfedezési szempontból vitathatatlan.,
érdemes rámutatni arra is, hogy jelenleg nincsenek FDA által megtisztított vagy jóváhagyott mNGS-tesztek, amelyeket mikrobiális tesztelésre lehet küldeni, bár vannak olyan laboratóriumok, amelyek az 1988-as klinikai laboratóriumi javulás módosításai (CLIA ’88) alapján tanúsítottak, amelyek klinikai mintákon tesztelnek. A mai napig az FDA csak néhány diagnosztikai NGS-rendszert törölte például a cisztás fibrózis onkológiai tesztelésére vagy kimutatására., Egy közelmúltbeli felülvizsgálat részletesen leírja számos szabályozási akadályt és megfontolást, amelyekkel foglalkozni kell, mielőtt az mNGS FDA által validált tesztként beléphetne a mainstream klinikai diagnosztikai laboratóriumokba.
összefoglaló, míg mNGS vizsgálat valószínűleg jelentős szerepet játszanak a mikrobiológiai diagnosztikai munkafolyamat a jövőben, különösen a sorozatot, de bioinformatic feldolgozási teljesítmény fejlődik, ez is egy nagy komplexitás technológia, amely a klinikai segédprogram a jelenlegi orvosi gyakorlat környezet továbbra is bizonytalan., Bár az mNGS tesztelése újszerű és izgalmas diagnosztikai klinikai lehetőségeket kínálhat a közeljövőben, valószínűleg egyik sem helyettesíti az ügyes klinikust egyhamar.