miután 1992-től 1995-ig a RADA-ban tanult, Macfadyen a brit színházban elsősorban a Cheek by Jol színpadi társasággal végzett munkájáról vált ismertté, amelyért Antonio-t játszotta Malfi Hercegnőjében, Charles Surface-t a Botrányiskolában, Benedick pedig a semmiről. A Benedicket egy tiszti osztály pojáca játszotta, bajuszos és bátor nevetéssel. 2005-ben a Királyi Nemzeti Színházban játszotta Hal herceget IV.Henrik első és második részében, Michael Gambon-nal Falstaff szerepében., 2007-ben visszatért a színpadra, egy amerikait, Clayt, egy otthon maradó apát ábrázolva, liberális hozzáállással a The Pain and the viszket című darabban.
A TV áttörés akkor jött, amikor Hareton Earnshaw-ként jelent meg az Üvöltő szelek adaptációjában, amelyet 1998-ban vetítettek az ITV hálózaton. További televíziós drámák következtek, köztük a Warriors (1999) és a The Way We Live Now (2001) című drámák főszereplői, mind a BBC számára. Szintén 2001-ben érdemelte ki az elismerést a BBC két, A Perfect Strangers című drámájában játszott főszerepéért, amelyet Stephen Poliakoff írt és rendezett., 2002-ben szerepelt a projektben, egy BBC drámában, amely a New Labor hatalomra jutását ábrázolja. Szerepelt a Spooks-ban, amely sikeres lett, amikor a BBC One-on vetítették. A második évadot 2003-ban vetítették, a harmadik évadot pedig 2004 őszén sugározták, amikor a második epizódban elhagyta a sorozatot. A sorozatot MI-5 néven sugározták az A& e hálózaton. 2007-ben megjelent Az egyszeri Channel 4 titkos élet című drámájában, amely a pedofília ellentmondásos témájával foglalkozott., Macfadyen elnyerte a legjobb színész díjat a Royal Television Society 2007 Awards-on, ezért BAFTA-ra jelölték. A Comic Relief rövid vázlatában szerepelt Mr. Bean esküvőjének vőlegényeként Rowan Atkinson és Michelle Ryan mellett.
Darcy Úr mellszobra, amelyet Matthew Macfadyen büszkén játszott& előítélet (2005 film)
Macfadyen megjelent az Enigma (2001-ben megjelent) filmekben, apám barlangjában, amiért megkapta az új-zélandi Screen Award-ot a legjobb színészért., 2005 szeptemberében jelent meg az Egyesült Királyságban a Pride and Prejudice adaptációjában, a Fitzwilliam Darcy című romantikus főszerepben.
Macfadyen szerepelt Frank Oz temetésen történt halálában és az Incendiary című filmben, Chris Cleave regénye alapján Michelle Williams és Ewan McGregor mellett. Ron Howard Frost / Nixon című filmjében is megjelent, amelyben John Birt-t játszotta. 2008-ban játszotta a férfi főszerepet Arthur clennam a BBC adaptációjában Charles Dickens kis Dorrit., 2009-ben Macfadyen az Oscar-díjra jelölt színésznő, Helena Bonham Carter mellett jelent meg a BBC négy Enid című filmjében, amely Enid Blyton életéről szól, mint Hugh Pollock, Blyton kiadója és első férje.
2010-ben a Nottingham seriffjét játszotta Robin Hood-ban. Ő játszott, mint Fülöp Perjel a TV soros Oszlopai A Földre, s a középkorú Logan Mountstuart Minden Emberi Szív. 2010 júniusában Macfadyen elnyerte a Brit Akadémia televíziós díját a legjobb támogató Színészért a büntető igazságszolgáltatásban végzett munkájáért.,
2011-ben Macfadyen a BBC Spooks című műsorának zárójelenetében, 2012-ben pedig Arkágyevics Sztepán szerepét játszotta Joe Wright filmjében, Anna Kareninában. 2012 decemberében a BBC One Hasfelmetsző utcájában kezdte meg Edmund Reid nyomozó ábrázolását.
2013-14 – ben Jeeves és Wooster Perfect Nonsense című produkciójában játszott a londoni West Endben a York-i Duke ‘ s Theatre-ben. A darab elnyerte a 2014-es Olivier-díjat a legjobb új vígjátékért.
2015-ben az Amazon Prime felvette a Ripper Streetet, és jó kritikák után a negyedik és ötödik évadra újra kiadták., Macfadyen azt mondta, hogy”örül, hogy újabb adag Hasfelmetsző utcai – vér és belek, zsebórák és viktoriánus fejfedő, csodálatosan sötét, mozgó és titokzatos történet vonalak Mr.Richard Wardlow”. A sorozat is sugárzott az USA-ban a BBC America. 2015-ben vendégszerepelt az utolsó királyság kísérleti epizódjában is.
jelenleg Tom Wambsgansként szerepel az HBO sorozatában, amelyért Primetime Emmy-díjat kapott.,
2020-ban Charles Ingram őrnagy szerepében jelent meg egy háromrészes ITV-drámában, kvízben, az ellentmondásos köhögési csalási botrány alapján, amely szerint Ki akar milliomos lenni 2001-ben.