Design a szintetikus acetil-CoA út

A legegyszerűbb módja annak, hogy szintetizálni szerves szén egy szén-dioxid-kibocsátású, hogy építeni egyenként., Annak érdekében, hogy egy mesterséges acetil-CoA utat építsünk egy szénből, javasoltuk a szintetikus acetil-CoA (SACA) utat, ahol két formaldehid molekula csak három lépésben kerül át egy acetil-CoA molekulába (Fig. 1a). Először is, a formaldehidet a glikolaldehid-szintáz (GALS) kondenzálja glikolaldehidbe (gals). Ezután a glikolaldehidet acetil-foszfáttá (AcP) alakítjuk át az acetil-foszfát-szintáz (acps) segítségével szervetlen foszfát alkalmazásával. Végül az AcP-t acetil-CoA előállítására használják az ismert acetil-transzferáz (PTA) 25 foszfát enzimmel., Eközben a formaldehid előállítható a szén-dioxid és a formula26 redukálásával, illetve a metán és a metanol oxidálásával.27 Így megvalósíthatjuk az acetil-CoA bioszintézisét formaldehidből, sőt más egy szénforrásokból is.

a SACA útvonal leírása és számítási elemzése. a A saca útvonal volt kiemelve a piros panel. A formaldehid fő alapanyaga lehet metanolból, formátból, sőt metánból és CO2-ből is., Az acetil-CoA terméke jelentős celluláris tápanyagok előállítására használható. b az acetil-CoA szintézis három tervezett útvonalának termodinamikai adatait az eQuilibrator weboldala hozta létre (http://equilibrator.weizmann.ac.il)., ΔrG vagyok: a teljes Gibbs-energia-változás; végre a következő Lépéseket: a szám a reakciók a formaldehid, hogy az acetil-CoA a vizsgált útvonalak; MDF: a maximális hajtóerő; Terméshozam: a teljes hozam szén a tanult utak; Coenzymes: a számos coenzymes használják a vizsgált útvonalak

A termodinamika is tükrözi, hogy egy út lehet eredményesen elvégzett in vivo vagy in vitro. Kiszámítottuk a tervezett SACA útvonal termodinamikai kémiai hajtóerejét., A formaldehidtől az acetil-CoA-ig terjedő általános reakció nagyon termodinamikailag kedvező, ahol a teljes reakció teljes Gibbs energiaváltozása (ΔrG ‘ m)körülbelül -96,7 kJ mol-1 (ábra). 1b és kiegészítő táblázat 1). Az MDF (maximális hajtóerő) értékét általában a különböző utak termodinamikai és kinetikai minőségének értékelésére használják28. Ha az MDF elég magas, az út nem tartalmaz termodinamikai szűk keresztmetszeteket, amelyek akadályoznák működését in vivo. A SACA útvonal viszonylag magas MDF értéket kapott 26.,9 kJ mol-1, ami nyilvánvalóan magasabb, mint az FLS és az MCC (MDF értékük 1,9, illetve 5,8 kJ mol−1). Ezért a SACA út termodinamikailag kedvező a formaldehidből származó acetil-CoA bioszintéziséhez.

egy új enzim azonosítása C1 – től C2-ig

a formaldehid kondenzációja katalizálható az n-heterociklusos karbinnal a chemistry29-ben, 30. A biológiában a kofaktor tiamin-difoszfát (ThDP) tiazoliumgyűrűje hasonló funkcióval rendelkezik, amely aktiválhat egy aldehidet, majd dimert képezhet egy másik aldehyde31-rel., Annak érdekében, hogy megtalálják egy enzim, az lecsapódik két molekula formaldehid egy molekula glycolaldehyde, már említett, a katalitikus mechanizmus ThDP-függő enzimeket, majd felépített egy theozyme modell, amely magában foglalja a ThDP, glycolaldehyde, valamint a glutaminsav, amely elektron a reaction32 (Fig. 2a). A Protein Data bankban (PDB) található összes enzimet gyakorlatilag a Theozyme modell alapján szűrték, és 37 nem redundáns proteinstruktúrát értek el ligand ThDP-vel (kiegészítő ábra. 1 és kiegészítő megjegyzés)., A thdp-függő enzimek katalitikus mechanizmusai szerint33, 34, 35, a C2 atom a ThDP-ben az aktív központ. A C2 atom és a glikolaldehid terméke közötti távolság kritikus a katalitikus reakció kiváltásához (1.ábra). 2a). Így elemeztük a C2 atom és a glikolaldehid közötti távolságot az egyes jelölt fehérjékben.

theozyme model construction and functional identification of the glicolaldehid synthase., a teozim modell kölcsönhatása a glikolaldehid és a különböző ThDP-függő enzimek aktív Centrumai között. A glutamát (glu) tan; a glikolaldehid Cián; a ThDP zöld. A Thdp-ben lévő C2 atom és a glikolaldehid szénatomok közötti távolságokat a d1 és d2 képviseli. A zöld pont magnézium-ion. b az egyes fehérjékben a D1 és d2 közötti átlagos távolságok (kék) a bal oldalon láthatók. A vizsgált fehérje termékmennyisége (sárga) a jobb oldalon látható. A reakciót úgy hajtottuk végre, hogy a vizsgált fehérjék közül 1 mg mL−1−et és 2 g l-1 formaldehidet adtunk hozzá. Nincs detektálás., A hibasávok S.d. (szórás), n = 3. C három funkcionális jelölt fehérje expressziója 1 mL 1 OD-sejt felhasználásával. M: protein marker; 1, 3 és 5 A 2uz1, 3FZN és 4k9q esetében IPTG nélküli fehérje expressziót jelent; 2, 4, illetve 6 a 2uz1, 3FZN és 4k9q esetében indukáló IPTG fehérje expressziót; a piros nyilak a 2uz1, 3FZN és 4k9q fehérjeszalagokra mutatnak. A forrásadatok Forrásadatfájlként vannak megadva.,

Alapján az átlagos távolságok az egyes fehérje segítségével molekuláris dokkoló (Kiegészítő Adatok 1)36, hat jelöltet rövid távolságok tisztán funkcionális megjegyzések kerültek meghatározásra, mint a jelöltek (Fig. 2b és 2. Kiegészítő táblázat). Ezenkívül három nagy távolságú fehérjét véletlenszerűen választottak kontrollként. A jelölteket és a kontrollokat úgy fejezték ki és tisztították meg, hogy teszteljék, képesek-e formaldehidből glikolaldehidet előállítani., Hat jelölt közül három mutatta ki a kívánt aktivitást, míg három kontrollnak nem volt funkciója, jelezve, hogy a C2 atom és a glikolaldehid közötti távolság kritikus szerepet játszik a formaldehid kondenzációjában. Három aktív jelölt közül a benzaldehid-lyáznak (BAL) nevezett 2uz1 fehérjét (https://www.rcsb.org/structure/2UZ1) a glikolaldehid minimális hozama ellenére, amikor a formaldehid koncentrációja alacsonyabb volt37., The other two proteins 3FZN (https://www.rcsb.org/structure/3FZN) and 4K9Q (https://www.rcsb.org/structure/4K9Q) that produce glycolaldehyde from formaldehyde were named as benzoylformate decarboxylases (BFD) in PDB database. And BFD (3FZN) from Pseudomonas putida was selected as candidate for subsequent modification since it has higher activity and expression level (Fig. 2c).,

Irányított evolúció a glycolaldehyde szintáz

Mivel a BAL volt tervezték, hogy készítsen DHA a formaldehyde22, javasoltuk, hogy észlelje, ha a megfelelő mutációk FTV is hozzájárulna, hogy javítsa az enzim aktivitását (Kiegészítő Ábra. 2). Az összes mutált maradék szűrésével valóban találtunk egy nagyon aktív w86r-N87T mutációt, amely a BFD szubsztrátcsatornájában található (kiegészítő ábra. 3). Így ezt a mutációt (W86R-N87T) bevezették a BFD-be, a változatot pedig M1-ként jelölték meg., További javítása érdekében a katalitikus aktivitás FTV tettünk javaslatot, hogy a képernyőn minden maradványok körül az aktív központ FTV, ahol 25 pozíciókat 8 Å távolságra az aktív centrum választottak ki, hogy egypontos telítettség mutagenitási (Kiegészítő Ábra. 4). A glikolaldehid és a difenil-amin közötti színreakcióval nagy áteresztőképességű szűrési módszert dolgoztunk ki a glikolaldehid kimutatására, amelyet 650 nm-es spektrofotometriás monitoron mértünk (kiegészítő ábra). 5)., A szűrés után kiderült, hogy a 25 pozícióból 14-nél magasabb aktivitást mutatott az M1 mutáns (kiegészítő ábra. 6). Ezt követően 14 pozíciót osztottak 8 csoportra: A (N27/G402), B (N27/S236), C (N27/A460), D (F397/C398), E (L109/L110), F (H281/Q282), G (N374/S378), és H (T379/T380). Az N27-et háromszor használták, mivel az ebben a helyzetben lévő változatok a legmagasabb aktivitást mutatták. Az M1-et mint sablont használva minden mutációcsoportot bevezettünk az M1-be, és kiválasztottuk a legmagasabb aktív mutánst, amit m2-nek neveztek., Elvégzésével három fordulóban iteratív kombinatorikus mutagenitási között ezeket a pozíciókat, mi teljesen árnyékolt 64,512 klónok, a kapott magas tevékenység mutáns, amely tartalmazza öt regény mutációk körül az aktív centrum. Végül a 7 maradékmutációval rendelkező változatot glikolaldehid-szintáznak (GALS) nevezték el. A GALS kcat-je körülbelül 160-szor javult, a GALS végső katalitikus hatékonysága pedig 9,6 m-1 * s-1, ami nagyjából 70-szerese a kiindulási enzimnek (ábra). 3a és kiegészítő ábra. 7).

protein engineering and mechanism analysis of the glicolaldehid synthase. a WT és mutánsok kinetikai paraméterei. WT: vad típus; M1: mutációk a W86R-nél és N87T-nél; M2: mutációk a w86r-nél, N87T-nél, L109G-nél és L110E-nél; M3: mutációk a w86r-nál, N87T-nél, L109G-nél, L110E-nél és A460M-nél; M4: mutációk a w86r-nél, N87T-nél, L109G-nél, L110E-nél, A460M-nél, H281V-nál, és Q282F. B a kiválasztott öt mutáció áttekintése az aktív központban. IMA: közbenső analóg; a narancssárga vonalak az IMA hidroxilcsoportja és az l110e mutáció közötti hidrogénkötéseket jelzik., c az M1, M2, M3 és M4 zsebmennyiségei. A rózsaszín pontok a kötőtűkövek térfogatát (2.Kiegészítő adat) jelölik, amelyek 131,25, 161,50, 133,38, illetve 171,38 Å3. A számokat az UCSF Chimera szoftver 1.1246 verziójával tették közzé. A forrásadatok Forrásadatfájlként vannak megadva.

annak érdekében, hogy kitaláljuk, hogyan javítják ezek a mutációk az enzimaktivitást, javasoltuk a GALS kristályosodásának újrakristályosítását. Az aktív zseb a gals38 homodimer felületén található., A GALS fehérje szerkezete több mutációs forduló után eltérhet a kiindulási fehérjétől. Itt kikristályosítottuk a GALS fehérjéjét, és a GALS kristályszerkezetét a BFD mint Keresési modell segítségével szereztük be (3.Kiegészítő táblázat). A GALS kristályszerkezetét elemeztük (kiegészítő ábra. 8, Kiegészítő Ábra. 9). Azt találtuk, hogy a mutáció a L110E vezet be két további hidrogén kötések a hidroxil csoport köztes analóg (IMA), amelyek hozzájárulhatnak a stabilizáló átmeneti állami hasító C–C kötelék termék kofaktor ThDP (Fig. 3b)., Az l109g mutációja megnövelte a szubsztrátkötő zseb térfogatát úgy, hogy a nagy izobutilcsoportot hidrogéncsoporttal helyettesítette. Az a460m harmadik mutációja átrendezheti a szubsztrátot, majd fokozhatja a thdp és a szubsztrát közötti kölcsönhatást. Az utolsó két mutáció, a H281V és a Q282F kiterjesztette a külső felület pórussugarát, és elősegítheti a szubsztráthoz vagy termékhez való hozzáférést (1. ábra). 3c). Az M1-hez képest a GALS reakciózsebének térfogata több mint 30% – kal nőtt, ami a katalitikus aktivitás javulásának fő oka lenne.,

az acetil-foszfát-szintáz azonosítása

a természetben nem számoltak be arról, hogy az AcP-k glikolaldehidből történő szintézisét elérnék. A foszfoketolázok (PKs) a fruktóz-6-foszfátból (F6P) vagy xilulóz-5-foszfátból (X5P)39 állíthatnak elő AKCS-t. A PKS katalitikus mechanizmusa szerint lehetséges, hogy a glikolaldehid kölcsönhatásba lép a ThDP-vel, majd 2-α,β-dihidroxi-etilidén-ThDP (Dhetdp) keletkezik (ábra. 4a), amely a legfontosabb köztes alkotó AcP F6P vagy X5P PKs. Hipotézisünk megerősítéséhez nyolc jelöltet választottunk ki (ábra., 4b) 111 baktériumcsaládból származó PKS filogenetikai fája alapján (kiegészítő ábra. 10). Génszintézis és fehérjetisztítás után (kiegészítő ábra. 11) megvizsgáltuk az összes jelölt fehérje katalitikus aktivitását glikolaldehid szubsztrátként. Szerencsére nyolc Pk-ból öt jelentős katalitikus tevékenységet mutatott. Csak a pk1, a PK4 és a PK8 nem mutatott szignifikáns különbséget az üres vezérléssel szemben. Így, PK2, a legmagasabb tevékenység nevezik acetil-foszfát-szintáz (AUTOMATA), akinek a kcat/Km-re eléri, hogy 3.21 M−1·k−1 (Kiegészítő Ábra. 12).,

az acetil-foszfát szintáz számítási elemzése és funkcionális azonosítása. a dhetdp képződése F6P/X5P-ből és glikolaldehidből. A szilárd nyilak a dhethdp formációs mechanizmusát képviselik a ref-ben. 39; a szaggatott nyilak jelzik az előre jelzett folyamatot glikolaldehid szubsztrátként. b az ACPS azonosítása. A kiválasztott nyolc Pk maximális valószínűségű filogenetikai fáját a MEGA47 készítette., A kiválasztott Pk-k részleteit a kiegészítő megjegyzés és a kiegészítő ábra tartalmazza. 10. Az egyes fehérjék aktivitását 0,5 mg mL−1 enzim és 10 mM-es glikolaldehid hozzáadásával detektáltuk. AKCS−acetil−foszfát, PK-foszfoketoláz, AKCS-termelés (µmol min-1 mg-1): az AcP-k mennyisége mg enzimenként percenként; kontroll: a reakciórendszerben nem adtak enzimet; a hibasávok S.d. (szórás), n = 3. c a dhethdp-képződési folyamat energiaprofilja., Az IM1 és az IM2 az alakítási folyamat során az 1. és 2. közbenső értéket képviseli; a TIM az IM1 és az IM2 közötti tautomerizált közbenső értéket; a TS1 és a TS2 az átmeneti állapotokat képviseli. A forrásadatok Forrásadatfájlként vannak megadva.

a dhethdp glikolaldehidből történő kialakításának mechanizmusának feltárására javasoltuk elméleti elemzés elvégzését a pk40 korábbi számítási modellje alapján. A dhetdp kialakulásához kapcsolódó összes lehetséges aminosavat felhasználták a számítási modell felépítéséhez (kiegészítő ábra. 13)., Számítási szimuláció alapján azt találtuk,hogy az energiagát csak 11, 36 kcal mol−1 az IM1 (intermediate 1) kialakulásához, amikor a glikolaldehidet his553 protonálta, amelyet a lehető legtöbb proton donor40-nek tekintettek (ábra. 4c). Ezután a Glu479 és a Glu437 segítségével az IM1 tautomerizálódik az IM2-be. Az IM2 energetikailag stabilabb, mint az IM1. Amikor az IM2 protonját az N4′ levette a ThDP-ben, az IM2-től a legfontosabb közbenső DHEThDP-ig terjedő energiagát 15.,13 kcal mol−1, amely ugyanolyan hasonló, mint a törzs energiája a DHEThDP kialakulása során, F6P-vel, mint szubsztrát40. A Dhetdp kialakulása után a következő katalitikus folyamatok megegyeznek a többi Pk-vel (kiegészítő ábra. 14), azaz a H97 a dhethdp dehidrációs folyamatának proton donorjaként működik, az His142 és a Gly155 pedig felgyorsítja a DHEThDP dehidrációs folyamatát, abból a tényből ítélve, hogy His142 és Gly155 hidrogénkötéseket képez a vízmolekulával a dehidráció utáni köztes (AcThDP) szerkezetében., A His64, a Tyr501 és az Asn549 fontos szerepet játszik a PI nukleofil támadásában, és ezek együttesen alkotják a Pi39 kötőhelyét. A helyszínen irányított mutagenezis kísérletek azt is jelezték, hogy ezek a maradványok döntő szerepet játszanak az enzimaktivitásban (kiegészítő ábra. 15).

acetil-CoA szintézise formaldehidből in vitro

a GALS and ACPS kezdeti sikeres kialakításával a saca útvonalat in vitro terveztük az acetil-CoA formaldehidből történő szintetizálására. Először is, a glikolaldehid hozamát GALS-szal mértük különböző formaldehid-koncentrációkban., Az eredmények azt mutatták, hogy a GALS hatékonyan katalizálja a formaldehid dimerizációját, a glikolaldehid hozama pedig a szubsztrát koncentrációjának javulásával nőtt (ábra. 5a). Például a formaldehidből származó glikolaldehid hozama 45%−ról 0,5 g L−1-ről 80% – ra nőtt 2 G L-1-nél. Másodszor, megvizsgáltuk a katalitikus hatékonyságot a glikolaldehidtől az AKCS-ig, amelyet az ecetsav tartalma számszerűsített, mivel az AKCS gyorsan ecetsavvá degradálódik (kiegészítő ábra. 16)23., Az eredmények azt mutatták,hogy az AKCS hozama több mint 80% – ot ért el különböző koncentrációjú glikolaldehid ACP-kkel (kiegészítő ábra. 17). Sajnos, ACPS nyilvánvalóan gátolja a formaldehid (ábra. 5b). Ezért egyensúlyt kell teremteni a formaldehid koncentrációjának a konfliktus megoldásában.

megerősítve az acetil-CoA formaldehidből történő bioszintézisét a SACA útvonalon in vitro. a glikolaldehid szintézise formaldehidből GALS által., Reakciók kivégezték alatt különböző formaldehid koncentrációja 2 mg mL−1 tisztított LÁNYOK, 37 °C-on 2 h. b gátlása AUTOMATA által formaldehid. Az ecetsav terméshozamát különböző időpontokban mértük reakciópufferrel, 2 mg mL-1 ACP-vel, 0,75 g l-1 glikolaldehiddel és a formaldehid gradiensével 0-2 g L−1-gyel, amelyet különböző színvonalak képviseltek. c Az ecetsav hozama különböző formaldehid koncentrációkból. A reakciókat egy éjszakán át 37 °C−on, reakciópufferrel, 2 mg mL−1 GALS, 2 mg mL-1 ACPS és 0-tól a formaldehid gradiensével végeztük.,5-2 g L-1. d ecetsav vagy acetil-CoA hozama 1 g l-1 formaldehidből. Az ecetsav vagy az acetil-CoA hozamát különböző időpontokban mértük. A kék vonal mutatja a reakció, rendszer, hogy készítsen acetil-CoA (20 mM CoA etetés tartalmazó 2 mg mL−1 tisztított LÁNYOK, AUTOMATA, valamint a PTA-kal); a narancssárga vonal a reakció, rendszer, hogy készítsen ecetsav (legfeljebb 2 mg mL−1 CSAJOK, valamint AUTOMATA nélkül CoA etetés). Az összes vizsgálatban a mintákat a HPLC elemezte. A hibasávok S.d. (szórás), n = 3., A forrásadatok Forrásadatfájlként vannak megadva.

a formaldehid koncentrációjának optimalizálása érdekében gradiens kísérletet végeztünk a 2 mg mL−1 GALS-t és ACPS-t tartalmazó reakciórendszer segítségével. A formaldehid koncentrációjának növelésével az ecetsav hozama a rendszerben kezdetben nőtt, majd csökkent (ábra. 5c). Ha a formaldehid koncentrációja 1 g L-1, az ecetsav hozama elérte az 50,6% – ot., Érdekes, hogy az ecetsav végső hozama még magasabb, mint a glikolaldehidből az AKCS-be ugyanolyan mennyiségű formaldehiddel (ábra. 5B, szürke vonal). Ennek oka az ACP-k funkciójának részleges felszabadulása lenne, mivel a formaldehidet a GALS fokozatosan fogyasztotta. E rendszer alapján további ismert enzimet, az acetil-transzferázt (PTA) adtunk hozzá, amely az AcP-t acetil-CoA-ra konvertálná. Végül a SACA útvonal 5,5 mM-es acetil-CoA-t termelt 1 g l−1 formaldehid koncentrációban. A formaldehidből származó acetil-CoA hozama körülbelül 33% volt (ábra. 5d)., A formaldehidből (33,3 mM) származó ecetsav (7,8 mM) hozama azonban elérte az 50% – ot, ha a PTA-t és a CoA-t nem szállították. Az acetil-CoA alacsonyabb terméshozamát, mint az ecetsavé, az acetil-CoA és az AcP instabilitása okozná. Eredményeink azt mutatták, hogy in vitro sikeres a formaldehidből származó acetil-CoA bioszintéziséhez a SACA úton.,

Érvényesítés, az segítsen, húzza ki út által 13C-címke

Miután megismerjük az út segítsen, húzza ki a tisztított enzim in vitro, mi a további kísérletet, hogy tesztelje a bioszintézis acetil-CoA pedig származékok, az segítsen, húzza ki utat in vivo által 13C-anyagcsere tracer vizsgálatok (Fig. 6a). Először a sejtlizátumokat használták az acetil-CoA bioszintézisének ellenőrzésére 13C-vel jelölt formaldehid és CoA hozzáadásával. A kettős 13C jelzésű acetil-CoA jelentős növekedését észleltük, mint más kontrollok (P-érték < 0.001, T-teszt) (ábra. 6B és kiegészítő ábra. 18)., Továbbá, a növekedés a kettős 13C-jelölt acetil-CoA eltűnt, ha elhagytuk az egyik gén a SACA út, mint például ACPS és PTA (kiegészítő ábra. 19). Ezenkívül az acetil-CoA oxaloacetáttal konvergálna, hogy belépjen a trikarbonsav (TCA) ciklusba. Azt is észlelte, lényegesen több kettős 13C-jelölt-fumarát (P-érték < 0.001, T-teszt), illetve maláttal (P-érték < 0.001, T-próba) csak a törzs, az segítsen, húzza ki út, valamint a 13C-jelölt formaldehid etetés (Fig. 6B és kiegészítő ábra. 18)., Azonban nem észleltünk jelentős különbségeket a magasabb rendű tömegizotopomerekben. Ennek oka az alacsony mennyiségű kettős 13C-jelölt izotopomerek a TCA ciklusban.

13C-vel jelölt metabolikus tracer analízis a SACA útvonalról. a vizsgált útvonal vázlatos diagramja a 13C-vel jelölt nyomjelző számára. b az M + 2 vegyületek frakciója celluláris lizátumokban, 13C-vel jelölt vagy címkézetlen formaldehiddel. c a 13C-vel jelölt metabolitok frakciója., A sejteket lb-ben indukálták és 13C-vel jelölt metanolt tartalmazó M9 közegbe szállították. Az intracelluláris metabolitokat 16 órás inkubáció után detektálták, a proteinogén aminosavakat pedig 26 órás inkubáció után mérték. Az észlelt izotopomerek összege 100% volt., 13C-FALD 13C-jelölt formaldehid, m + 0, anélkül, 13C címke, m + 1 egyszemélyes 13C címke, m + 2 dupla 13C címke, FALD formaldehid, MeOH metanol, GALD glycolaldehyde, Akcs-acetil-foszfát, Asp aszpartát, Glu glutamát, PEP phosphoenolpyruvate, segítsen, húzza ki a törzs tartalmazza a vektor LÁNYOK-AUTOMATA-PTA-28a, 28a, a törzs tartalmazza az üres vektor a 28a, BsMDH-segítsen, húzza ki a törzs tartalmazza mindkét BsMDH-pCDF, LÁNYOK-AUTOMATA-PTA-28a vektorok, BsMDH-28a: a törzs tartalmazza mindkét BsMDH-pCDF vektor, valamint az üres vektor 28a. Hiba sávok képviselik s.d. (szórás), n = 3., A forrásadatok Forrásadatfájlként vannak megadva.

ezt követően azt javasoltuk, hogy teszteljük a szén áramlását a sejtekben. A formaldehid sejtekre gyakorolt toxicitása miatt a Bacillus stearothermophilus (BsMDH)41 metanol-dehidrogenázt vezettük be, hogy in vivo folyamatosan alacsony formaldehid-koncentrációt tartsunk fenn (ábra. 6a). A tenyésztett sejteket különböző időpontokban szüretelték, és proteinogén aminosavak és intracelluláris metabolitok kimutatására használták (1.ábra). 6c)., Megállapítottuk, hogy a saca pathway (BsMDH-SACA) törzs több kettős 13C-jelű aszpartátot és glutamátot tartalmazott, amelyek a TCA ciklusból származtak. Ezenkívül a 13C-jelű glükózt és foszfoenolpiruvátot, amely a kettős 13C-jelű oxaloacetátból származhat a glükoneogenezis útján, a bsmdh-SACA törzsben jobban detektálták, mint a kontroll törzsben (BsMDH-28a). Így eredményeink azt mutatták, hogy a SACA útvonal funkcionális acetil-CoA és acetil-CoA-származtatott metabolitok formaldehidből történő előállítására.,

A saca útvonal Sejtnövekedéssel történő értékelése

a saca útvonal in vivo további értékelése érdekében azt javasoltuk, hogy a sejtnövekedést lépésről lépésre teszteljük az út minden közbülső adagolásával. Kezdetben az E. coli a gazdag közeg alatt nőtt fel, majd kiegészítő szénforrásként glikolaldehidet adtak hozzá. Hozzáadásával különböző koncentrációjú glikolaldehid (kiegészítő ábra. 20), Azt találtuk, hogy a mesterséges törzs, amely tartalmazza a SACA útvonal több mint 0.,4 g l−1 glikolaldehid ellátás figyelemre méltó magasabb OD600, mint azok a törzsek nélkül glikolaldehid vagy a SACA út (ábra. 7a és kiegészítő ábra. 21). A glikolaldehid hozzájárulása a biomasszához (celluláris száraz tömeg, CDW) 0,681 ± 0,028 gcdwg−1 (n = 3) glikolaldehid volt.

a saca útvonal Sejtnövekedéssel történő értékelése. 0,4 g l-1 glikolaldehidet kiegészítő szénforrásként alkalmazó sejtnövekedési vizsgálatok., b sejtnövekedési vizsgálatok 80 mg L−1 formaldehid felhasználásával kiegészítő szénforrásként. a C−sejt növekedési vizsgálata 8 g l-1 metanolt használ kiegészítő szénforrásként. A sejteket kezdetben lb közegben tenyésztették. IPTG-t adtak a fehérje expressziójának kiváltásához, majd hozzáadták a kiegészítő szénforrásokat. Az OD600-At különböző időpontokban észlelték., SACA a törzs tartalmazza a vektor GALS-ACPS-PTA-28A, 28a a törzs tartalmazza az üres vektor 28A, BsMDH-SACA a törzs magában foglalja mind BsMDH-pCDF és GALS-ACPS-PTA-28A Vektorok, BsMDH-28a a törzs tartalmazza mind BsMDH-pCDF vektor és az üres vektor 28A, nincs GALS a törzs tartalmazza az összes gén az úton, kivéve GALS, + hozzátéve kiegészítő szénforrás, − nélkül kiegészítő szénforrás, GLIKOLALDEHID (gald), formaldehid (Fald), metanol (meoh). A hibasávok S.d. (szórás), n = 3. A forrásadatok Forrásadatfájlként vannak megadva.,

amikor a sejtnövekedést formaldehidet kiegészítő szénforrásként teszteltük, az üres vektorral rendelkező törzs növekedését 80 mg L−1 formaldehid gátolta (1.ábra). 7b). A saca pathway-t tartalmazó törzset kezdetben gátolták, majd normálisan ugyanabban az állapotban nőtt fel, amelyet a formaldehid gyorsabb fogyasztása okozhat, mint az üres vektorral rendelkező törzs (kiegészítő ábra. 22)., Sajnos a saca pathway-t tartalmazó törzsnek nem volt több biomassza a formaldehid kiegészítésével, mint a formaldehid nélküliek. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy bár a saca útvonal hatékonyabb a mérgező formaldehid eltávolítására, nem elegendő a biomassza biztosítása.

végül a saca útvonalat metanol táplálásával kívántuk értékelni, amelyet folyamatosan formaldehiddé alakítunk át. Megállapítottuk, hogy mind a BsMDH, mind a SACA útvonalat tartalmazó törzs magasabb OD600-mal rendelkezik, mint a metanol-ellátás vagy a SACA útvonal nélküli kontrollok (ábra). 7c és kiegészítő ábra., 23). 26 órás inkubáció után azt találtuk, hogy az OD600 értéke a bsmdh-t és a SACA-utat tartalmazó törzsben körülbelül 0,2-rel nőtt, ami szignifikánsan magasabb, mint a saca-út nélküli törzs (P-érték = 0,005, T-teszt). A saca útvonal nélküli törzshöz képest azt találtuk, hogy a metanolból származó biomassza mennyisége 0,03 ± 0,006 gcdw g−1 (n = 3) metanol volt a saca útvonalat tartalmazó törzsben.