A genetikai kapcsolatok közötti DNS-javító utak, valamint az emberi rák hajlam táplálják érdeklődés a fehérjék, hogy felismeri, javítás, egyedi helyek a DNS-károsodást. A javítóenzimek rendkívül konzerváltak a baktériumoktól a gombákig az emberig, hangsúlyozva a genomikus integritás fenntartására vonatkozó prémiumot a mutagén terhekkel szemben., A DNS érzékeny a replikáció során elkövetett hibák, valamint a környezeti tényezők, például sugárzás, oxidálószerek vagy alkiláló szerek által okozott károkra. A javítási reakciók magukban foglalják a kémiailag megváltozott vagy hibás bázisok kivágását a DNS duplexből. A keletkező hézagokat DNS-polimerázok töltik ki; ez a reakció nick-t hagy a javítás helyén vagy szegélyezi. A kromoszómális DNS-replikáció során hasonló folyamat lép fel, amelynek során az Okazaki-fragmensek folytonos szintézisét elsődleges 5′ – RNS-szegmenseket kivágják, a beavatkozó réseket pedig DNS-polimeráz tölti ki.,

a DNS-javítási és replikációs útvonalak egy közös utolsó lépésben konvergálnak, amelyben a javított DNS-szál folytonosságát helyreállítja a DNS-ligáz, egy enzim, amely a nicks-t foszfodiészter kötésekké alakítja. A Nicks potenciálisan káros DNS-elváltozások, amelyek, ha nem korrigálják, halálos kétszálú töréseket okozhatnak. Ennek megfelelően a DNS-ligáz funkció teljes elvesztése halálos.

DNS-ligáz reakció

a DNS-ligázok katalizálják az 5′-foszfát-végződésű szál 3′-hidroxil-végződésű szálhoz való csatlakozását., A ligálás magnéziumtól és nagy energiájú kofaktortól függ, akár ATP, akár nad+. A reakciómechanizmus 3 szekvenciális nukleotidiltranszfer reakciót tartalmaz. Az első lépésben az ATP (adenozin-trifoszfát) vagy a NAD+ (nikotinamid-adenin-dinukleotid) alfa-foszforja elleni nukleofil támadás ligázzal pirofoszfát vagy NMN (nikotinamid-mononukleotid) felszabadulását eredményezi, és kovalens köztes (ligáz-adenilát) képződését eredményezi, amelyben az AMP foszfoamid (P-N) kötéssel kapcsolódik a lizin epszilon-amino csoportjához., A második lépésben az erősítőt az 5′-foszfát-végződésű DNS-szál 5′ – végére helyezzük át, hogy DNS-adenilát — fordított pirofoszfát-hídszerkezetet képezzünk, AppN. Ebben a reakcióban a DNS-szál 5 ‘ – foszfát oxigénje megtámadja a ligáz-adenilát foszforátját; az aktív hely lizin oldallánc a kilépő csoport. A harmadik lépésben a ligáz katalizálja a DNS-adeniláton lévő nick 3’-OH-ját, hogy csatlakozzon a 2 polinukleotidhoz és felszabadítsa az erősítőt.

filogenetikai Eloszlás

az élő szervezetek 3 domént tartalmaznak: eubacteria, archaeabacteria és eukarióták., Minden szervezet 1 vagy több DNS-ligázt kódol. A ligázok 2 családba, ATP-függő ligázokba és NAD+-függő ligázokba vannak csoportosítva, a ligáz-adenilát képződéshez szükséges nukleotid szubsztrát szerint. Az ATP-függő DNS-ligázok mind a 3 doménben megtalálhatók. A NAD + -függő DNS-ligázok (LigA) mindenütt jelen vannak a baktériumokban, ahol nélkülözhetetlenek a növekedéshez, és vonzó célpontokat jelentenek a fertőzésellenes gyógyszerek felfedezéséhez. A NAD + – függő ligázok csak szórványosan fordulnak elő az élet bakteriális tartományán kívül, például,, halofil archaeákban és bizonyos DNS-vírusokban, és feltehetően horizontális géntranszfer útján szerezték be ezeket a taxonokat.

eukarióta sejtes ATP-függő Ligázok

az ATP-függő DNS ligázok minden eukarióta fajban megtalálhatók. Az emlős sejtek négy DNS-ligáz izozimot tartalmaznak. Aminosav-szekvencia, összehasonlítások azt mutatják, hogy a core katalitikus domain közös ATP-függő ligases díszítette további izoenzim-specifikus területeken található az amino, vagy karboxil termini a fehérjék., Úgy gondolják, hogy ezek a szegélyező szegmensek közvetítik az emlős DNS-ligázok kötődését a DNS-replikációban, javításban és rekombinációban részt vevő más fehérjékhez. Az emlős izozimokat ligáz I, ligáz IIIa, ligáz IIIb és ligáz IV. DNS ligáz I egy 919-aminosav polipeptid, minden szövetben kifejezve, amely katalizálja az Okazaki fragmensek csatlakozását a DNS replikáció során, és szerepet játszik a DNS javításában is., A DNS-ligázok IIIa (922 aminosav) és IIIb (862 aminosav) egyetlen gén termékei; aminosav-szekvenciájukban csak a karboxil terminijükben különböznek az alternatív mRNS-splicing következtében. A ligáz IIIa mindenütt kifejeződik, és szerepet játszik a DNS javításában, és elengedhetetlen a mitokondriális funkcióhoz. A ligáz IIIB expresszió a herékre korlátozódik, különösen a meiózisban szenvedő spermatocitákra. A DNS ligáz IV egy 911-aminosav-polipeptid, amely szerepet játszik a kettős szálú DNS-törések javításában nem homológ végcsatlakozással (NHEJ).,

az élesztősejtek 2 külön kódolt DNS-ligázt tartalmaznak, amelyek homológak az I. és IV. emlős DNS-ligázokra. A Saccharomyces cerevisiae kezdő élesztő DNS-ligáz I (Cdc9p) elengedhetetlen a sejtek növekedéséhez. A genetikai kísérletek az I. ligázt az Okazaki-fragmensek lezárására és a DNS-kivágás javításának befejezésére irányítják. Ezzel szemben az élesztő DNS ligáz IV nem nélkülözhetetlen a sejtek növekedéséhez. A LIG4 gén törlése azonban fenotípusokat vált ki, jelezve, hogy a ligase IV katalizálja a kettős szálú szünetek javítását a nem homológ végcsatlakozási útvonalon (NHEJ)., A kezdő élesztőnek nincs látható homológja az emlős DNS-ligáz III.

vírusos ATP-függő DNS-Ligázok

bakteriális DNS-vírusok, például a T4, T6, T7 és T3 E. coli bakteriofágok, saját ATP-függő DNS-ligázokat kódolnak. Az ATP-függő DNS-ligázokat eukarióta DNS-vírusok is kódolják, amelyek replikációs ciklusuk egy részét vagy egészét a citoplazmában vezetik. Ezek közé tartozik a vaccinia vírus, az afrikai sertéspestis vírus és a Chlorella vírus PBCV1. A bakteriofág és az eukarióta virális DNS-ligázok kisebbek, mint sejtes társaik., A Vaccinia DNS-ligáz, egy 552 aminosav-polipeptid, feltűnően hasonló az aminosav-szekvencia szintjén az emlős DNS-ligáz III-hoz. valójában a ligáz III szorosabban kapcsolódik a vaccinia ligázhoz, mint az I és IV emlős ligázokhoz. a T4 (487 aminosav), a T7 (359 aminosav), a T3 (346 aminosav) és a Chlorella vírus (298 aminosav) ligázai még kisebbek. Megmutattuk, hogy a Chlorella vírus ligáz kiegészítheti egy élesztőtörzs növekedését, amelyben a DNS ligase I gént törölték., Ez az eredmény azt sugallja, hogy a sokkal nagyobb DNS-ligáz i-re jellemző fehérjeszegmensek nem nélkülözhetetlenek az élesztősejtek növekedéséhez.

Nick-érzékelés DNS Ligázokkal

megvizsgáltuk az eukarióta ligázok DNS-vel való kölcsönhatását vírus által kódolt enzimek modellként. A Vaccinia vírus DNS-ligáza és Chlorella vírus DNS-ligáz különálló komplexet alkotnak, külön-külön DNS-ligandummal, magnézium hiányában, amely natív poliakrilamid gél-elektroforézissel oldható meg a szabad DNS – ből., A vírusos ligases nem alkotnak stabil komplexeket a következő ligandumok: (i) a DNS-t, amely egy 1-nukleotid-vagy 2-nukleotid rés; (ii) a lezárt duplex DNS termék a ligálási reakció; (iii) önállóan megsértette duplex, amely egy 5′-Ó terminus a nick helyett 5′-foszfát; vagy (iv) egy önállóan megsértette duplex, amely egy RNS-szál 5′-foszfát oldalon a nick (10, 15). Így a vírusos ATP-függő DNS-ligázok belső nick-érzékelő funkcióval rendelkeznek.,

Nick elismerés által antivakcinia DNS ligase, valamint Chlorella vírus DNS ligase attól is függ, jelenlét az AMP kötelező zseb az enzim — azaz mutációk a ligase aktív az oldalon, hogy töröljék el a képességét, hogy létrehozzák a ligase-adenylate közbenső is megszüntesse nick elismerés; mivel egy mutáció, ami megőrzi ligase-adenylate kialakulását, de hatástalanítja a downstream lépés a strand csatlakozott reakció hatása nem kötelező, hogy megsértette a DNS-t., Az extrahelikális nukleotid DNS-kötésű ligázzal történő megkötése emlékeztet a célterület felismerésének és katalízisének más DNS-módosítás és-javító enzimek által használt” bázis-flipping ” mechanizmusára.

bár az 5′-foszfát rész elengedhetetlen a Chlorella vírusligáz DNS-hez való kötődéséhez, a 3 ‘ – OH rész nem szükséges a nick felismeréshez. A Chlorella vírus ligáz egy 2′, 3′ didoxi és 5′-foszfát termini tartalmú ligandumhoz kötődik, de nem katalizálja az 5’-end adenilációját., Így a 3 ‘ -OH fontos a 2.lépés kémiájához, annak ellenére, hogy a DNS-adenilát képződése során önmagában nem alakul át kémiailag.

a ligáz-DNS-felület körvonalazásához a ligáz-kötőhelyet a DNS-re nyomtuk. A ligáz exonukleáz III lábnyomának mérete, amely egyetlen Nickhez kötődik a duplex DNS-ben, 19-21 nukleotid. A lábnyom aszimmetrikus, a nick 3′-OH oldalán 8-9 nukleotid, az 5′-foszfát oldalán pedig 11-12 nukleotid található.,

az eukarióta DNS-ligáz-adenilát kristályszerkezete

A Chlorella vírus DNS-ligáz (ChVLig)a legkisebb eukarióta ATP-függő ligáz. Mint a “minimális” DNS-ligáz, vonzó célt mutatott a szerkezet meghatározására. Kristályosítottuk a ChVLig-et, és 2 Å felbontásban határoztuk meg a szerkezetét. Az enzim egy nagyobb N-terminális nukleotidiltranszferáz (Ntáz) doménből és egy kisebb C-terminális OB doménből áll, köztük hasadékkal. Egy erősítő rész kovalensen kapcsolódott a Lys27 NZ-hez az aktív helyszínen., Így van egy valódi katalitikus köztes szerkezetünk.

az ntase tartományon belül egy adenilát-kötő zseb, amely a kovalens nukleotid-transzferáz enzimet (i, Ia, III, IIIa, IV és V) meghatározó hat peptidmotívumból (i, ia, III, IIIa, IV és V) áll, amely a DNS-és RNS-ligázokat, valamint az mRNS-megkötő enzimeket tartalmazza. Motívum I (KxDGxR) tartalmazza a lizin, amelyhez AMP válik kovalensen kapcsolódik az első lépésben a ligáz reakció. Az IA, III, IIIa, IV és V érintkező erősítőben lévő aminosavak alapvető szerepet játszanak a ligációs út egy vagy több lépésében., Az OB domain egy ötszálú antiparallel béta hordóból, valamint egy alfa helixből áll.

szerkezeti alapja Nick felismerés minimális “pluripotens” DNS ligáz

bár ChVLig hiányzik a nagy n – vagy C-terminál szegélyező domének találhatók eukarióta sejt DNS ligázok, képes fenntartani mitotikus növekedés, DNS javítás, és nem homológ végén összekötő kezdő élesztő, ha ez az egyetlen forrása a ligáz a sejtben. A ChVLig még az emlős Lig3 alapvető funkcióit is elvégezheti a mitokondriális DNS-anyagcserében., Azt javasoltuk, hogy a ChVLig egy lecsupaszított “pluripotens” ligázt képvisel a belső nick érzékelési funkciójának köszönhetően, amelynek alapját megvilágítottuk, amikor megoldottuk a ChVLig-AMP 2.3 Å kristályszerkezetét, amely egy 3′-OH/5′-PO4 Nickhez kötődik duplex DNS-ben.

a ChVLig a DNS-t C-alakú fehérjebilincsként veszi körül. Az NTase domain kötődik a törött és ép DNS szálak a fő horony szegélyező a nick, valamint a kisebb horony a 3′-OH oldalán a nick. Az OB domain kötődik az egész kisebb horony az arcon a duplex mögött nick., Egy új” retesz ” modul-amely egy béta – hajtűhurokból áll, amely az OB tartományból származik-elfoglalja a fő horonyt, és a hurok csúcsa és az NTase tartomány felülete közötti érintkezőkön keresztül befejezi a kerületi bilincset. A retesz kritikus a bilincs bezárásához, és a nick-érzékelés kulcsfontosságú meghatározója.

a szabad és nick-kötött ChVLig-AMP kristályszerkezeteinek összehasonlítása egy nagy domén átrendeződést mutat, amely nick-felismerést kísér., A szabad ChVLig-AMP-ben az OB domain tükröződik az NTase doméntől, hogy teljes mértékben felfedje a DNS-kötő felületet az erősítő-kötő zseb felett. Az a peptidszegmens, amely a reteszgé válik, rendezetlen a szabad ligázban, és érzékeny a proteolízisre. De ez a szegmens védve van a proteolízistől, amikor a ChVLig kötődik a nikkelezett DNS-hez. A DNS-kötés az OB-tartomány közel 180 forgását vonja maga után egy forgó körül, így az OB béta-hordó homorú felülete illeszkedik a DNS-moll horonyba., Ez az átmenet az OB domén 63 Å mozgását idézi elő, és a reteszt mélyen a DNS fő horonyba helyezi.

az aktív helyen a 3′-OH és 5′-PO4 terminivel való kölcsönhatások hálózata megvilágította a DNS adenililációs mechanizmusát és az erősítő kritikus szerepét a nick-érzékelésben és katalízisben. A kétértékű kation hozzáadása nick tömítést váltott ki crystallo-ban, ezáltal megállapítva, hogy a nick komplex jóhiszemű közbenső a DNS-javítási útvonalon.,

A nad+-függő DNS-ligáz szerkezete, amely a DNS-adeniláthoz kötődik

nad + – függő DNS-ligázok (a továbbiakban: LigA) az összes baktériumban található enzimek jellegzetes és strukturálisan homogén kládja. Az E. coli LigA (671-aa) a család prototípusa. A LigA moduláris felépítésű, egy NTase doménből és egy OB doménből álló központi ligázmag köré épült. A magot egy N-terminális “Ia” domain és három C-terminális modul szegélyezi: egy tetracisztein cink-ujj, egy helix-hajtű-helix (HhH) domain és egy BRCT domain., A ligációs útvonal minden lépése a LigA domainek egy másik részhalmazától függ, minden lépéshez csak az NTase domainre van szükség. Az IA Domain egyedülálló a NAD + – függő ligázok esetében, felelős a NAD+ NMN részeinek kötéséért, és a NAD+-val való reakcióhoz szükséges a ligáz-AMP közbenső kialakításához.

megállapítottuk, hogy a NAD+-függő E. coli DNS-ligáz támogathatja a Saccharomyces cerevisiae törzsek növekedését, amelyeket egyenként töröltek a CDC9-re vagy kétszeresen a CDC9 plus LIG4-re., Ez az első bizonyíték arra, hogy egy nad + – függő enzim biológiailag aktív egy eukarióta szervezetben. A későbbi vizsgálatok (Maria Jasinnal együttműködve) azt mutatták, hogy az E. coli LigA elegendő lehet A ligáz funkcióhoz az egér ES sejtekben, amelyek nem rendelkeznek az alapvető Lig3 enzimmel.

az E. coli LigA kristályszerkezete, amely a DNS-adenilát közbülső részéhez kötődik, kimutatta, hogy a LigA a DNS helixet C-alakú fehérjebilincsként is körülveszi. A protein-DNS interfész kiterjedt DNS-kapcsolatokat von maga után az NTase, OB és HhH doménekkel egy 19 bp-es duplex DNS-szegmensben, amely a Nickre összpontosít., Az NTase domain kötődik a törött DNS-szálakhoz a nicknél, az OB domain érintkezik a nick körüli folyamatos sablonszálakkal, a HhH domain pedig mindkét szálat összeköti a lábnyom perifériáján lévő kisebb horonyon. A ZN-finger modul szerkezeti szerepet játszik az OB és HhH tartományok áthidalásában. A Domain Ia nem érintkezik a DNS duplex-szel, összhangban azzal, hogy az appdna szubsztrátumon a szálzárás katalízisére alkalmas.,

A LigA NTase és OB domének az ATP-függő DNS-ligázok NTase és OB doménjeihez hasonlóan helyezkednek el, és a DNS-szálak hasonló szegmenseit “lábnyomozzák”. A LigA bilincs topológiája azonban nagyon különbözik a ChVLig és a humán DNS ligáz 1 (HuLig1, Tom Ellenberger és kollégái által meghatározva) által alkotott fogóktól. A Ligafogót lezáró csókolózó érintkezők a sui generis, amely magában foglalja az NTase domaint és a C-terminal HhH domaint., A rendelkezésre álló szerkezeti adatok alapján egyértelmű,hogy a DNS-ligázok legalább három különböző módon fejlődtek ki a DNS körül.

Az E. coli LigA—AppDNA komplex összehasonlítása a bináris LigA•—nad+ komplex (1.lépés szubsztrát), a bináris LigA•—NMN komplex (az 1. lépés utáni elhagyó csoport), valamint a kovalens ligáz-AMP intermedier (1. lépés a csoport disszociációja után) struktúráival a szubsztrátkötéssel és katalízissel szinkronban előforduló masszív fehérjetartén átrendeződéseket (50-90 Å sorrendben) emeli ki., A DNS-kötődés és a ligák által történő szorítás az OB domén közel 180 forgását vonja maga után, így az OB béta-hordó homorú felülete illeszkedik a kisebb horonyba, hasonlóan a ChVLig és a HuLig1 esetében látottakhoz vagy következtetésekhez. A HHH domén négypontos kötődése a LigA-DNS lábnyom perifériáján stabilizálja a DNS-kanyart a nick közepén. A LigA-DNS kölcsönhatások azonnal szegélyező nick indukálja a helyi DNS torzítás, ami elfogadása RNS-szerű a-forma helix, ismét visszhangozza a megállapítások a HuLig1-DNS cocrystal.,

A lizin-adenilezés mechanizmusa ATP-függő és NAD+-függő polinukleotid ligázokkal

a polinukleotid ligázok auto-adenilezési reakcióját egy nukleotidiltranszferáz (Ntáz) domén végzi, amely ATP-függő DNS-és RNS-ligázokban, valamint NAD+ – függő DNS-ligázokban megmarad. Az NTase domain magában foglalja a nukleotidkötő zsebet alkotó peptidmotívumok meghatározását. A motívum I (KxDG) tartalmazza a lizint, amely kovalensen kapcsolódik az erősítőhöz. Mint Robert Lehman rámutatott 1974-ben, nem világos, hogy a lizin (a várható pKa értéke ~10.,5) elveszíti protonját fiziológiás pH-n, hogy elérje az ATP vagy NAD + α-foszforja elleni támadáshoz szükséges nem bizonyított állapotot. Elvileg a ligáz általános bázist alkalmazhat a lizin deprotonálásához. Alternatív megoldásként a PKA-t a lizin-Nz-t körülvevő fehérje aminosavak pozitív töltéspotenciálja csökkentheti. Számos kristályszerkezetek ligázok hiányzik Fémek nyújtott csekély támogatást mindkét magyarázat. Ezekben a struktúrákban az I lizin nukleofil motívum egy motívum mellett található IV glutamát vagy aszpartát oldallánc., A lizin és a motívum IV karboxilát egy ionpárt alkotnak, amelynek várható hatása a lizin pKa-jának növelése a környező negatív töltés miatt. Nem valószínű, hogy egy glutamát vagy aszpartát anion általános bázisként szolgálhat egy proton kivonására a lizin kationból. A probléma egyik lehetséges megoldása az lenne, ha egy kétértékű kation a lizin-Nz-vel ütközne, és a pKa-ját hajtaná le.,

a Naegleria gruberi RNS-ligáz (NgrRnl) legújabb kristályszerkezetéből kiderült, hogy az ATP-vel és mangánnal (az előnyben részesített fém kofaktorral) rendelkező 1.lépés. A Michaelisz-szerű komplex elfogásának kulcsa a lizin nukleofil izoszterin metionin helyettesítése volt. Az 1,9 Å-es szerkezet ATP-t és két mangánionot tartalmazott az aktív telephelyen. A” katalitikus ” fémet oktaéderes geometriával öt vizre hangolták össze, amelyeket az I., III.és IV. motívumokban konzervált maradványok karboxilát oldalláncai koordináltak., A katalitikus fémkomplexum hatodik ligandum helyét egy ATP α-foszfát oxigén foglalta el, ami azt jelzi, hogy a fém szerepet játszik az auto-adenilezési reakció átmeneti állapotának stabilizálásában. A Michaelis-komplexnek a kovalens NgrRnl-(Lys–Nz)-AMP intermediate szerkezetére vonatkozó szuperpozíciójával megerősített kulcsfontosságú betekintés a katalitikus fémkomplexnek a katalízis előtt a lizin nukleofil nem protonált állapotának stabilizálásában játszott szerepét érintette, a Lys-Nz helyi pozitív töltése és atomi érintkezése révén a fémhez kötött vizek egyikéhez., Az NgrRnl Michaelis komplex egy második fémet mutatott ki, amely oktaéderenként négy vizre, valamint ATP β-És γ-foszfátoxigénekre oszlik. A fém-komplex, valamint az ATP γ-foszfát jegyese volt egy zenekar aminosav oldalon láncok (egyedi NgrRnl) együttesen orient a PPi indul csoport csúcsi, hogy a lizin nucleophile. Egylépcsős in-line mechanizmussal összhangban az α-foszfátot sztereokémiailag megfordították az NgrRnl * ATP Michaelis komplexről a lizil-AMP intermedierre való áttérés során.,

úgy gondolják, hogy a DNS-ligázok az RNS-ligázoktól elkülönítve fejlődtek ki, kezdetben egy ősi ATP-hasznosító Ntáz domén C-terminális OB doménre történő fúziójával (egy DNS-ligáz minimális katalitikus magját képezve), majd további szerkezeti modulok fúziójával az NTASE-OB maghoz (7). A NAD+-függő DNS-ligázok (Ligaenzimek), amelyek mindenütt jelen vannak a baktériumokban, és nélkülözhetetlenek a baktériumok életképességéhez, egy NMN-kötő ia doménmodul n-terminusához történő fúziójával szerezték meg a NAD + specifikusságát., Az Escherichia coli DNS-ligáz (EcoLigA) volt az első felfedezett és jellemzett sejtes DNS-ligáz, amely továbbra is a NAD+ – függő DNS-ligáz család szerkezeti és funkcionális vizsgálatának elsődleges modellje. A LigA mechanizmus iránti érdeklődést a LigA megcélzásának ígérete hajtja végre (a NAD+ szubsztrát specificitása és az emberi DNS-ligázokkal szembeni egyedi szerkezeti jellemzők révén) az anti-bakteriális kábítószer-felfedezéshez.

megoldottuk az EcoLigA 1,55 Å kristályszerkezetét, mint egy nad+ és magnézium komplexet., A szerkezet felfedi egy fém mechanizmus, amely egy ligase kötött Mg2+(H2O)5 komplex csökkenti a lizin pKa, valamint bevonja a NAD+ α-foszfát, de a β-foszfát, illetve a nikotinamid-nukleozid a NMN indul csoport-orientált kizárólag keresztül atomi kölcsönhatások fehérje elemek, amelyek egyedülálló, hogy a LigA klád. A kétfém (ATP-függő ligáz esetén) az egyfémmel szemben (NAD+-függő ligáz esetén) a dichotómia elágazási pontot határoz meg a ligáz evolúciójában.