Suunnittelu synteettinen asetyyli-CoA-polku

yksinkertaisin tapa koota orgaanisen hiilen yhdestä-hiili on rakentaa se yksi kerrallaan., Jotta rakentaa keinotekoinen asetyyli-CoA polku yhdestä hiili, ehdotimme Synteettinen Asetyyli-CoA (SACA) koulutusjakso, jossa kaksi molekyylejä formaldehydi siirrettäisiin osaksi yhden molekyylin asetyyli-CoA läpi vain kolme vaihetta (Kuva. 1 A). Ensinnäkin, formaldehydi olisi tiivistetty glycolaldehyde (GALD), jonka glycolaldehyde nopaliinisyntaasin (TYTÖT). Ja sitten glykolaldehydi muunnettaisiin asetyyli-fosfaatiksi (AKT) asetyylifosfaattisyntaasilla (ACPS) epäorgaanista fosfaattia käyttäen. Lisäksi Aktia käytettäisiin asetyyli-CoA: n tuottamiseen tunnetulla fosfaattiasetyylitransferaasientsyymillä (PTA)25., Samaan aikaan formaldehydiä voidaan saada pelkistämällä hiilidioksidia ja formaattia26 tai hapettamalla metaania ja metanolia27. Näin voisimme toteuttaa asetyyli-CoA: n biosynteesin formaldehydistä ja jopa muista yhden hiilen resursseista.

termodynamiikan voi pohtia, onko reitti voidaan tehokkaasti suorittaa in vivo tai in vitro. Laskimme suunnitellun SACA-reitin termodynaamisen kemiallisen käyttövoiman., Yleinen reaktio formaldehydin asetyyli-CoA on erittäin termodynaamisesti edullisin, jossa koko Gibbsin energian muutos (ΔrG olen) koko reaktio on noin -96.7 kJ mol−1 (Fig. 1b ja Lisätaulukko 1). MDF: n arvoa (enimmäisajovoima) käytetään yleensä arvioimaan eri reittien termodynaamista ja kineettistä laatua28. Jos MDF-levy on riittävän korkea, reitti ei sisällä termodynaamisia pullonkauloja, jotka haittaisivat sen toimintaa In vivo. SACA-polku sai suhteellisen korkean MDF-arvon 26.,9 kJ mol−1, joka on selvästi korkeampi kuin sks: n ja MCC väyliä (niiden MDF-arvot ovat 1,9 ja 5.8 kJ mol−1, vastaavasti). Siksi SACA reitti on termodynaamisesti edullisin biosynteesin asetyyli-CoA-formaldehydi.

Tunnistaminen romaani entsyymin C1-C2

kondensaatio formaldehydi voi olla katalysoivat N-heterosyklisten karbiini vuonna chemistry29,30. Biologia, thiazolium rengas kofaktorina tiamiinin difosfaatti (ThDP) on samanlainen toiminto, jonka voi aktivoida yksi aldehydi ja sitten muodostaa dimeerin kanssa toinen aldehyde31., Jotta löytää entsyymi tiivistyä kaksi molekyylejä formaldehydi osaksi yhden molekyylin glycolaldehyde, me tarkoitetut katalyyttiset mekanismit ThDP-riippuvaisten entsyymien ja rakennettu theozyme malli, joka sisältää ThDP, glycolaldehyde, ja glutamiinihappo, joka tarjoaa electron varten reaction32 (Fig. 2 a). Kaikki entsyymien Protein Data Bank (PDB) olivat lähes seulotaan perustuu theozyme malli ja 37 ei-tarpeeton proteiini rakenteita ligandin ThDP saavutettiin (Supplementary Fig. 1 ja lisähuomautus)., Thdp: stä riippuvaisten entsymien33,34,35 katalyyttisten mekanismien mukaan C2-atomi on thdp: ssä aktiivinen keskus. C2-atomin ja glykolaldehydin tuotteen välinen etäisyys on kriittinen katalyyttisen reaktion käynnistämiseksi (Kuva. 2 a). Näin analysoimme C2-atomin ja glykolaldehydin välisen etäisyyden kussakin proteiinikandidaatissa.

Perustuu keskimääräiset etäisyydet kunkin proteiinin käyttäen molekyylien telakointi (Täydentävä tieto 1)36, kuusi ehdokasta, jossa lyhyet etäisyydet ja selkeä toiminnallinen merkintöjä määriteltiin ehdokkaat (Fig. 2b ja Lisätaulukko 2). Lisäksi kontrolleiksi valittiin satunnaisesti kolme proteiinia, joilla oli pitkät etäisyydet. Ehdokkaat ja kontrollit ilmaistiin ja puhdistettiin testaamaan niiden kykyä tuottaa glykolaldehydiä formaldehydistä., Kolme kuudesta ehdokkaat esillä toivottua toimintaa, kun taas kolme valvontaa ei ole toiminto, joka osoittaa, etäisyys C2 atom ja glycolaldehyde on tärkeä rooli tiivistymistä formaldehydiä. Joukossa kolme aktiivista ehdokasta, proteiini 2UZ1 (https://www.rcsb.org/structure/2UZ1), joka oli kutsutaan bentsaldehydia lyase (BAL), on raportoitu ensisijaisesti tuottaa dihydroksiasetoni (DHA), vaikka minimaalinen tuotto glycolaldehyde, kun formaldehydin pitoisuus oli lower37., The other two proteins 3FZN (https://www.rcsb.org/structure/3FZN) and 4K9Q (https://www.rcsb.org/structure/4K9Q) that produce glycolaldehyde from formaldehyde were named as benzoylformate decarboxylases (BFD) in PDB database. And BFD (3FZN) from Pseudomonas putida was selected as candidate for subsequent modification since it has higher activity and expression level (Fig. 2c).,

Suunnattu kehitys glycolaldehyde nopaliinisyntaasin

Koska BAL oli suunniteltu tuottamaan DHA formaldehyde22, ehdotimme havaita, jos vastaava mutaatioita BFD olisi myös osaltaan parantaa entsyymin toimintaa (Supplementary Fig. 2). Seulomalla kaikki mutatoitunut jäämiä, me todellakin löytyy erittäin aktiivinen mutaatio W86R-N87T joka sijaitsi alustan kanava BFD (Supplementary Fig. 3). Näin ollen mutaatio (W86R-N87T) otettiin BFD ja variantti oli merkitty M1., Jotta edelleen parantaa katalyyttinen aktiivisuus BFD, ehdotimme näytön kaikki jäämät noin aktiivinen keskus BFD, jossa 25 kantoja sisällä 8 Å etäisyys aktiivinen keskus valittiin tekemään yhden pisteen kylläisyyttä mutageneesi (Supplementary Fig. 4). Olemme kehittäneet high-throughput seulonta lähestymistapa tunnistaa glycolaldehyde värin välinen reaktio glycolaldehyde ja difenyyliamiini, joka mitattiin spectrophotometrically seurata 650 nm (Supplementary Fig. 5)., Seulonnan jälkeen huomasimme, että 14 25: stä paikasta osoitti suurempaa aktiivisuutta kuin M1-mutantti (täydentävä Kuva. 6). Myöhemmin, 14 kannat olivat jaettu 8 ryhmään: (N27/G402), B (N27/S236), C (N27/A460), D (F397/C398), E (109/110), F (H281/Q282), G (N374/S378), ja S (T379/T380). N27: ää käytettiin kolme kertaa, koska tässä asennossa olevat muunnokset osoittivat suurinta aktiivisuutta. Käyttämällä M1 malli, otimme käyttöön kunkin ryhmän mutaatiot osaksi M1 ja valittu korkein aktiivinen mutantti, joka oli merkitty M2., Tekemällä kolme kierrosta iteratiivinen kombinatoriset mutageneesi näistä kantoja, olemme täysin seulotaan 64,512 klooneja ja saada korkea aktiivisuus mutantti, joka sisältää viisi romaani mutaatioita noin aktiivinen keskus. Lopulta muunnos, jossa oli 7 jäämämutaatiota, nimettiin glykolaldehydisyntaasiksi (GALS). Se kcat TYTTÖJÄ oli parantunut noin 160-kertaiseksi ja lopullinen katalyyttinen tehokkuus GALS on 9.6 M−1·s−1, joka on noin 70-kertainen kuin alkaa entsyymi (Fig. 3a ja täydentävä Kuva. 7).

jotta voit selvittää, miten nämä mutaatiot parantaa entsyymin toimintaa, ehdotimme uudelleen kiteytyminen TYTÖT. Aktiivinen tasku sijaitsee gals38: n homodimeerin rajapinnassa., GALSIN proteiinirakenne voi poiketa lähtöproteiinista useiden mutaatiokierrosten jälkeen. Täällä, me kiteytynyt proteiini TYTÖT ja haetaan kiderakenne TYTÖT käyttää rakenne BFD kuten haku-malli (Täydentävä Taulukko 3). GALSIN kiderakenne analysoitiin (täydentävä Kuva. 8, Täydentävä Kuva. 9). Huomasimme, että mutaatio L110E esittelee kaksi uutta vetysidokset, että hydroksyyli-ryhmä, väli-analoginen (IMA), joka voi osaltaan vakauttaa siirtyminen valtion ja pilkkomaan C–C-sidos tuote-ja kofaktorina ThDP (Fig. 3 B)., Mutaatio L109G laajentunut määrä substraattia sitova tasku korvaamalla iso isobutyyli-ryhmän vety-ryhmä. A460M: n kolmas mutaatio voi ohjata substraattia uudelleen ja parantaa sen jälkeen thdp: n ja substraatin välistä vuorovaikutusta. Kaksi viimeistä mutaatiota H281V ja Q282F laajensivat ulkopinnan huokosädettä ja voivat helpottaa substraatin tai tuotteen pääsyä (Kuva. 3 C). Vertaamalla M1, tilavuus reaktio tasku TYTÖT oli laajentunut yli 30%, mikä olisi tärkein syy parantaminen katalyyttinen toiminta.,

Tunnistaminen asetyyli-phosphate synthase

luonnossa, ei entsyymiä ilmoitettiin saavuttaa synteesi Akt alkaen glycolaldehyde. Fosfoketolaasit (PKs) voivat tuottaa AKT-yhdisteitä fruktoosi-6-fosfaatista (F6P)tai ksyluloosi-5-fosfaatista (X5P) 39. Mukaan katalyyttinen mekanismi PKs, on mahdollista, että glycolaldehyde vuorovaikutuksessa ThDP ja luo sitten 2-α -, β-dihydroxyethylidene-ThDP (DHEThDP) (Fig. 4a), joka on PKS: n keskeinen Välituote AKT: n muodostamisessa F6P: stä tai X5P: stä. Vahvistaaksemme hypoteesimme valitsimme kahdeksan ehdokasta (Kuva., 4b) perustuu PKs: n fylogeneettiseen puuhun 111 bakteeriperheestä (täydentävä Kuva. 10). Geenisynteesin ja proteiinien puhdistuksen jälkeen(täydentävä Kuva. 11) tutkimme kaikkien ehdokasproteiinien katalyyttistä aktiivisuutta käyttäen glykolaldehydiä substraattina. Onneksi viidestä kahdeksasta PKs: stä näkyi merkittävää katalyyttistä toimintaa. Vain PK1, PK4, ja PK8 ei osoittanut merkittävää eroa tyhjän ohjaus. Näin, PK2 korkein aktiivisuus oli kutsutaan nimellä asetyyli-phosphate synthase (AKT), jonka kcat/Km saavutetaan 3.21 M−1·s−1 (Supplementary Fig. 12).,

paljastaa mekanismi muodostaen DHEThDP alkaen glycolaldehyde, ehdotimme suorittaa teoreettinen analyysi perustuu edellisen laskennallinen malli PK40. Laskennallisen mallin (täydentävä Kuva) rakentamiseen käytettiin kaikkia mahdollisia DHEThDP: n muodostumiseen liittyviä aminohappoja. 13)., Perustuu laskennallinen simulointi, huomasimme, että energia este on vain 11.36 kcal mol−1 muodostumista IM1 (väli 1) kun glycolaldehyde oli protonoidut, jonka His553, joka oli pitää kuin useimmat mahdollista proton donor40 (Fig. 4 C). Sitten IM1 tautomeroituu IM2: ksi Glu479: n ja Glu437: n avustuksella. IM2 on energisesti vakaampi kuin IM1. Kun protoni ja IM2 oli riisuttu pois N4′ in ThDP, energia este IM2 avain väli DHEThDP on 15.,13 kcal mol−1, joka on samanlainen kuin kanta, energiaa muodostumisen aikana DHEThDP käyttäen F6P kuin substrate40. DHEThDP: n muodostumisen jälkeen seuraavat katalyyttiset prosessit ovat samat kuin muut PKs: t (täydentävä Kuva. 14), toisin sanoen, H97 toimii protonin luovuttajan nestehukka prosessi DHEThDP, ja His142 ja Gly155 nopeuttaa kuivumista prosessi DHEThDP, päätellen siitä, että His142 ja Gly155 muodostaa vetysidoksia veden kanssa molekyylin rakenteen post-nestehukka väli (AcThDP)., His64, Tyr501, ja Asn549 ovat tärkeitä nukleofiiliset hyökkäys Pi ja ne yhdessä muodostavat sitova sivusto Pi39. Sivuston suunnattu mutageenisuus kokeet myös osoittivat, että nämä jäämät ovat keskeinen entsyymin toimintaa (Supplementary Fig. 15).

Synteesi asetyyli-CoA-formaldehydi in vitro

alkuperäiseen onnistunut suunnittelu TYTÖT ja AKT-maiden, meillä on tarkoitus rakentaa SACA pathway in vitro syntetisoimaan asetyyli-CoA-formaldehydi. Ensinnäkin me mittasimme GLYKOLALDEHYDIN saantoa GALEILLA eri formaldehydipitoisuuksilla., Tulokset osoittivat, että TYTÖT voivat tehokkaasti katalysoivat dimerization formaldehydiä, ja tuotto glycolaldehyde lisääntynyt pitoisuus alustan parantunut (Kuva. 5 a). Esimerkiksi, tuotto glycolaldehyde formaldehydi kasvoi 45% 0,5 g L−1 80% 2 g L−1. Toiseksi, tutkimme katalyyttinen tehokkuus alkaen glycolaldehyde Akt, joka oli määrällisesti pitoisuus etikkahappoa, koska Akt-maiden olisi nopeasti huonontunut etikkahappoa (Supplementary Fig. 16)23., Tulokset osoittivat, että tuotto Akt saavutti yli 80% eri pitoisuuksia glycolaldehyde kautta AKT (Supplementary Fig. 17). Valitettavasti acps: n toimintaa esti ilmeisesti formaldehydi(Kuva. 5 b). Näin ollen on tarpeen ottaa tasapaino pitoisuus formaldehydi tämän konfliktin ratkaisemiseen.

jotta voidaan optimoida pitoisuus formaldehydi, kaltevuus kokeilu suoritettiin käyttämällä reaktio-järjestelmä, joka sisältää 2 mg mL−1 TYTÖT ja AKT-maissa. Formaldehydin pitoisuuden kasvaessa etikkahapon saanto järjestelmässä kasvoi aluksi ja laski sitten (kuva. 5 C). Kun formaldehydin pitoisuus on 1 g L−1, saanto etikkahappoa oli 50,6 prosenttia., Mielenkiintoista, lopullinen tuotto etikkahappo on jopa korkeampi kuin, että reaktio järjestelmän glycolaldehyde Akt-maiden kanssa sama määrä formaldehydiä (Fig. 5B, harmaalinja). Tämä olisi aiheuttanut osittain vapauttaa toimintaa AKT-maissa, koska formaldehydi on vähitellen kulutetaan by TYTÖT. Perusteella tämän järjestelmän, meillä on vielä lisätty toinen tunnettu entsyymi fosfaatti-asetyylitransferaasin (PTA), joka muuntaa Akt osaksi asetyyli-CoA. Lopuksi SACA-reitti tuotti 5,5 mM asetyyli-CoA formaldehydipitoisuudella 1 g L−1. Asetyyli-CoA: n saanto formaldehydistä oli noin 33% (Kuva. 5d)., Etikkahapon (7,8 mM) saanto formaldehydistä (33,3 mM) nousi kuitenkin 50 prosenttiin, jos PTA: ta ja CoA: ta ei toimitettu. Asetyyli-CoA: n pienempi saanto kuin etikkahapon, johtuisi asetyyli-CoA: n ja AKT: n epävakaudesta. Tuloksemme osoittivat, että se on onnistunut asetyyli-CoA: n biosynteesissä formaldehydistä SACA-reitin kautta in vitro.,

Validointi SACA koulutusjakso, jonka 13C-merkintöjä

varmistuttuaan SACA polku puhdistetulla-entsyymien vaikutuksesta in vitro, olemme edelleen yrittänyt testata biosynteesiä asetyyli-CoA-ja se on johdoksia päässä SACA pathway in vivo, jonka 13C-aineenvaihdunnan merkkiaineen määritykset (Kuva. 6 A). Ensinnäkin solulysaatteja käytettiin asetyyli-CoA: n biosynteesin todentamiseen lisäämällä siihen 13C-merkittyä formaldehydiä ja CoA: ta. Meidän havaittu merkittävää kasvua kaksinkertainen 13C-leimattua asetyyli-CoA kuin muut säätimet (P-arvo < 0.001, T-testi) (Kuva. 6B ja täydentävä Kuva. 18)., Lisäksi kaksinkertaiset 13C-leimattua asetyyli-CoA katosi, jos me pois yksi geenien SACA koulutusjakson, kuten AKT-maiden ja PTA (Supplementary Fig. 19). Lisäksi asetyyli-CoA konvergoituisi oksaloasetaatin kanssa trikarboksyylihapon (TCA) sykliin. Meillä on myös havaittu merkittävästi enemmän kaksinkertainen 13C-leimattua fumaraatti (P-arvo < 0.001, T-testi) ja malaten (P-arvo < 0.001, T-testi) vain rasitusta SACA reitti-ja 13C-leimattu formaldehydi ruokinta (Fig. 6B ja täydentävä Kuva. 18)., Emme kuitenkaan havainneet merkittäviä eroja suuremmissa kertaluvun isotopomeereissa. Se johtuisi siitä, että TCA-syklissä on pieni määrä kaksinkertaisia 13C-merkittyjä isotopomeereja.

tämän Jälkeen ehdotimme testi hiilen virtausta soluihin. Johtuen myrkyllisyyden formaldehydiä solujen käyttöön metanoli kohonnut Bacillus stearothermophilus (BsMDH)41 ylläpitää jatkuvasti alhainen pitoisuus formaldehydi in vivo (Kuva. 6 A). Viljellyt solut korjattiin eri ajankohtina, ja niitä käytettiin proteinogeenisten aminohappojen ja solunsisäisten metaboliittien (Fig. 6 c)., Huomasimme, että rasitusta SACA polku (BsMDH-SACA) sisälsi yli kaksinkertainen 13C-leimattua aspartaatti ja glutamaatti, joka on johdettu TCA sykli. Lisäksi 13C-leimattua glukoosia ja phosphoenolpyruvate, mikä saattaa tuottaa kaksinkertainen 13C-leimattua oxaloacetate kautta glukoneogeneesiä polku, havaittiin enemmän rasitusta BsMDH-SACA kuin ne, valvonta-kanta (BsMDH-28a). Näin ollen tulokset osoittivat, että SACA reitti on toimiva tuottaa asetyyli-CoA-ja asetyyli-CoA-johdettu aineenvaihduntatuotteiden formaldehydiä.,

Arvioinnin SACA polku solun kasvua

jotta edelleen arvioida SACA pathway in vivo, ehdotimme testata solujen kasvua vaiheittain syöttämällä kunkin väli-koulutusjakson. Aluksi E. coli kasvoi alle rikas keskipitkän ja sitten glycolaldehyde lisättiin täydentäviä hiilen lähde. Lisäämällä erilaisia glykolaldehydipitoisuuksia (täydentävä viikuna. 20), huomasimme, että suunniteltu kanta, joka sisältää SACA-reitin yli 0.,4 g L−1 glycolaldehyde tarjonta on merkillistä korkeampi OD600 kuin ne kannat ilman glycolaldehyde tai SACA reitti (Kuva. 7a ja täydentävä Kuva. 21). Osuus glycolaldehyde biomassaa (solujen kuivapaino, CDW) oli 0.681 ± 0.028 gCDWg−1 (n = 3) glycolaldehyde.

Kun testasimme solujen kasvua käyttämällä formaldehydiä kuin täydentävää hiilen lähde, kasvu rasittaa tyhjä vektori oli täysin estetty 80 mg L−1-formaldehydi (Fig. 7 B). Kanta sisältää SACA reitti oli estetty aluksi ja sitten kasvoi normaalisti sama sairaus, joka voi johtua sen nopeammin formaldehydiä kulutus kuin kanta tyhjä vektori (Supplementary Fig. 22)., Valitettavasti rasitusta sisältävät SACA polku ei ole enemmän biomassaa täydentää formaldehydiä kuin ilman formaldehydiä. Nämä tulokset osoittivat, että vaikka SACA reitti on tehokkaampi poistamaan myrkyllisiä formaldehydiä, se ei riitä antamaan biomassaa.

lopulta aioimme arvioida SACA-reitin syöttämällä metanolia, joka jatkuvasti muuttuisi formaldehydiksi. Huomasimme, että kanta, joka sisältää sekä BsMDH ja SACA reitti on korkeampi OD600 kuin ne tarkastukset ilman metanolia tarjonnan tai SACA reitti (Kuva. 7c ja täydentävä Kuva., 23). Jälkeen 26 h inkuboinnin, huomasimme, että arvo OD600 vuonna rasitusta sisältävät sekä BsMDH ja SACA polku nousi noin 0,2, joka on huomattavasti korkeampi kuin rasitusta ilman SACA polku (P-arvo = 0.005, T-testi). Vertaamalla rasitusta ilman SACA-reitin, huomasimme, että biomassan määrä johdettu metanoli oli 0.03 ± 0.006 gCDW g−1 (n = 3) metanolia kanta, joka sisältää SACA polku.