Seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) menetelmät alkoivat näkyä kirjallisuudessa 2000-luvun puolivälissä ja oli muokkaava vaikutus meidän käsitys mikrobien genomiikka ja tartuntataudit. Siellä on kuitenkin paljon kiistelyä siitä, miten, milloin ja missä seuraavan sukupolven sekvensointi on merkitystä kliinisen diagnostisen laboratorion., Syvä sukellus piste-kontrapunkti keskustelua päässä Journal of Clinical Microbiology käsitellään haasteita ja mahdollisuuksia, joita voi tulla käyttöön metagenomic seuraavan sukupolven sekvensointi (mNGS) osaksi rutiinia laboratorioissa. Mikä on mNGS ja miten se eroaa monista muista nukleiinihapon teknologioiden siellä?

mikä on Metagenomic Next Generation-sekvensointi?

Seuraavan sukupolven sekvensointi on useita korkea suoritusteho sekvensointi menetelmät, jossa miljardeja nukleiinihapon palasia voi olla samanaikaisesti ja itsenäisesti sekvensoitiin., Kontrasti tämä tekniikka klassisen menetelmiä, kuten Sanger sekvensointi (tunnetaan myös nimellä dideoxynucleotide ketjun päättymisen sekvensointi), joka käsittelee yhden nukleotidin sekvenssi per reaktio.
luonnehtia bakteeri genomin käyttää NGS, esimerkiksi genomin on jaettu useita palasia, jotka tuottavat sekvenssit tai lukee muutamasta sadasta kymmeniä tuhansia tukikohdat pituus. Sekvenssit kootaan yhteen genomiin laskennallisten lähestymistapojen avulla. Useita päällekkäisiä järjestyksessä lukee kasattiin yhdessä tuottaa yksi pidempi sekvenssi kutsutaan contig., Siellä ovat usein erot contigs ja vaikka hifi-enää järjestyksessä lukee olisi ihanteellinen menetelmä sekvensointi, alustoja, jotka tuottavat lyhyempi lukee, ovat yleensä vähemmän kalliita ja päällekkäisiä sekvenssejä tekee niistä tarkempia. Konstruoitu genomi (joka sisältää todennäköisesti aukkoja) on linjassa organismin tunnistamista varten perustetun vertailutietokannan kanssa. Tämä tekniikka on merkittävä edistysaskel alkuaikoina sekvensointi, kun yksi bakteeri genomin projekti voi kestää useita vuosia.,
Metagenomic NGS (mNGS) on yksinkertaisesti käynnissä kaikki nukleiinihapot näytteessä, joka voi olla sekoitettu väestön mikro-organismeja, ja määrittämällä nämä niiden viite genomeja ymmärtää, mitkä mikrobit ovat läsnä ja missä suhteessa. Kyky järjestyksessä ja tunnistaa nukleiinihapot useista eri taksonien varten metagenomic analyysin avulla tämä tehokas uusi foorumi, joka voi samanaikaisesti tunnistaa geneettinen materiaali täysin eri valtakunnat organismeja.,
mahdollisia kliinisiä sovelluksia ovat valtavat, mukaan lukien diagnoosi tartuntatautien, puhkeaminen seuranta, infektio, valvonta -, ja mutaatio ja taudinaiheuttaja löytö, monien muiden joukossa. mNGS, joskus kutsutaan haulikko sekvensointi, kliiniset näytteet on sovellettu eri näyte-tyypit, mukaan lukien aivo-selkäydinneste, veri, hengitys-näytteitä, ruoansulatuskanavan nestettä, ja silmän nesteen.

Mitä Hyötyä Metagenomic Seuraavan Sukupolven Sekvensointi?,

suurin vahvuus mNGS on, että se on puolueeton hypoteesi-vapaa diagnostinen menetelmä, toisin kuin suunnattu polymeraasiketjureaktio (PCR -) menetelmiä, jotka luottavat alukkeet tunnistaminen erityisiä tavoitteita, jotta voidaan täydentää ja havaita. Vaikka yleinen tai laaja-alaisen PCR-menetelmät eivät ole riittävän kattava, jotta sitä voidaan pitää metagenomic,, koska ne käyttää erityisiä alukkeita säilytetty 16S ribosomaalisen RNA (rRNA) geeni ja sisäinen puhtaaksi välikappale (SEN) sekvenssit täydentää erottuva nukleiinihapposekvenssejä, jotka voivat olla bioinformatically luokiteltu bakteerien ja arkkien, tai sienten vastaavasti.,
Universal primers aiheuttaa ongelmia myös polymikrobisten infektioiden diagnosoinnissa molekyylitesteillä. Jos polymeeripopulaatioita esiintyy käytettäessä 16S-sekvensointia, nukleotidia kohti tehdään useita emäspuheluja, jotka tuottavat sekanukleotidikrobikromatogrammin, jota ei voida tulkita. Vaikka on olemassa de-konvoluutio-laskennallisia menetelmiä ennustaa eliöiden tunnistettu, nämä ovat ei-standardi käyttää monet laboratoriot, jotka usein refleksi seuraavan sukupolven sekvensointi 16S-geenin polymicrobial näytteitä.,

mitkä ovat Metagenomisten seuraavan sukupolven sekvensoinnin haasteet?

Vaikka potentiaalia mNGS, on monia esteitä selvää, ennen kuin tekniikka voi tulla osa valtavirran laboratorio, sekä aukkoja ymmärrystä sen diagnostiikka-apuohjelman. Suurimmat varaukset ovat tulkinta havainnoista (erottaa saastuminen ja kolonisaatio tosi taudinaiheuttajia), valinta ja validointi tietokantoja käytetään analyysit ja ennustaminen (tai sen puute) mikrobilääkkeiden tunteet., Yleinen käsitys on, että mNGS on niin uskomattoman herkkä, että se paljastaa diagnoosi, kun kaikki muut testaus on negatiivinen. Kun mNGS voidaan analyyttisesti herkempi kuin vakio viljelyn menetelmiä, joissakin tapauksissa, on tarpeen poistaa valtavia määriä ihmisen nukleiinihapon aikana sekvensointi valmistelu ja (by laskennallisia menetelmiä) aikana post-analyyttinen prosessi, voi vähentää herkkyyttä verrattuna kohdennettuja PCR lähestymistapoja monille eliöille.

mngs: n erityisyys pysyy huoneessa sananparrena elefanttina., Kontaminaatio näytteiden aikana näytteen keräys on suuri huolenaihe, kun otetaan huomioon lisääntynyt analyyttinen herkkyys mNGS verrattuna standardi kulttuurin menetelmiä, ja siellä on oltava validoitu laatu-valvonta-prosessi käytössä muun muassa arvioitaessa reagenssin puhtaus mittaus riittävä genomin kattavuus valvontaa. Lisäksi joillakin Illumina-alustoilla voidaan määrittää väärät viivakoodi-indeksit, mikä johtaa vääriin positiivisiin sekvensointitietoihin., Bioinformatiikka-laadun valvonta on tarpeen sen varmistamiseksi, että korkea laatu ja validoitu genomit ovat saatavilla kanssa minimaalinen tietokanta virheitä ja ei olisi mieluiten oltava bioinformatiikka henkilöstön saatavilla tulkita sekvensoinnin tulokset kunkin testin, joka ei ole saatavilla useimmissa kliinisissä mikrobiologian laboratorioissa., Federal Drug Administration (FDA) on tehnyt yhteistyötä muiden liittovaltion virastojen kappalainen tietokanta oikeus FDA-ARGOS (FDA-tietokanta sääntely-luokan mikrobien sekvenssit), joka on ollut hyödyllistä varmistaa, että nykyinen mNGS tulokset ovat luotettavia ja tarkkoja, mutta niitä täytyy päivittää ja ylläpitää.
suurempi kysymys jää ympäröivän kliininen spesifisyys mNGS: On havaittu sekvenssit taudinaiheuttajia, jotka osallistuvat potilaan nykyinen sairaus?, Analyyttinen spesifisyys mNGS testaus voidaan käsitellä tiukkaa valvontaa koko näytteen keräys, sekvensointi kirjasto valmistelu, assay ajaa, ja bioinformatiikka-luokitus, mutta kliininen spesifisyys on ei suoraan käsitellä näitä lähestymistapoja. Kysymyksiä, jotka voivat auttaa määrittämään, kliininen hyödyllisyys ja sovellettavuus ovat: Miten voimme erottaa organismit, jotka liittyvät ohimenevää bakteremiaa suun/ruoansulatuskanavan kasviston tai ihon siirtomaavallat veren – /plasma-mNGS testaus?, Miten sekvensointisyvyys olisi raportoitava ja kuinka luotettava on sekvenssisyvyyden suhde todelliseen infektioon? Onko tämä suhde erilainen taudinaiheuttajan/isännän mukaan? Kuinka kauan mngs: n odotetaan havaitsevan taudinaiheuttajan puoliintumisajan, kun potilas on saanut asianmukaista parantavaa hoitoa? Tutkimukset kliininen hyödyllisyys ja kustannustehokkuus ovat suuresti tarpeen huolimatta kiistaton valta tämän teknologian tutkimukseen ja löytö näkökulmasta.,
Se on myös syytä huomauttaa, että ei ole tällä hetkellä FDA-selvitetty tai hyväksytty mNGS testit, jotka voidaan lähettää mikrobien testaus, vaikka laboratoriot sertifioitu Kliininen Laboratorio Parantaminen Tarkistukset 1988 (CLIA ’88), jotka tarjoavat testaus kliinisiä näytteitä. Tähän mennessä FDA on selvittänyt vain muutamia diagnostisia NGS-järjestelmiä esimerkiksi kystisen fibroosin onkologiseen testaukseen tai havaitsemiseen., Tuoreessa katsauksessa kuvataan yksityiskohtaisesti monia lainsäädännöllisiä esteitä ja näkökohtia, jotka on ratkaistava ennen kuin mNGS voisi tulla valtavirtaa kliinisen diagnostiikan laboratorioissa, kuten FDA-validoitu testi.
yhteenvetona, kun mNGS testaus voi todennäköisesti pelata merkittävä rooli mikrobiologinen diagnostiikka työnkulku tulevaisuudessa, varsinkin kun sekvensointi ja bioinformatiikka laskentatehoa kehittyy, tämä on edelleen korkea-monimutkaisuus, teknologia, josta kliinistä hyötyä meidän nykyisen hoitokäytännön ympäristö on edelleen epävarma., Vaikka mNGS testaus voi tarjota uudenlaisia ja jännittäviä diagnostisten kliininen mahdollisuuksia lähitulevaisuudessa, se ei todennäköisesti korvata ansiokas lääkäri lähiaikoina.