oxidase-test registrerer tilstedeværelsen af en cytochrom oxidase system, der vil fungere som katalysator for transport af elektroner mellem elektron donorer i bakterier og en redox-dye – tetramethyl-p-phenylendiamin. Farvestoffet reduceres til dyb lilla farve., Denne test bruges til at hjælpe i identifikation af Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella og Pasteurella, som alle, der producerer enzymet cytochrom oxidase.

et antal reagenser kan anvendes til denne test.,

• Kovacs Oxidase Reagent:

1% tetra-methyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water

• Gordon and McLeod’s Reagent:

1% dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water

• Gaby and Hadley (indophenol oxidase) Reagent:

1% α-naphthol in 95% ethanol

1% p-aminodimethylaniline HCL

Principle of Oxidase Test

Cytochrome containing organisms produce an intracellular oxidase enzyme. This oxidase enzyme catalyzes the oxidation of cytochrome c., Organismer, der indeholder cytokrom c som en del af deres åndedrætskæde, er O .idasepositive og gør reagenset blåt/lilla. Organismer, der mangler cytokrom c som en del af deres åndedrætskæde, o .iderer ikke reagenset, efterlader det farveløst inden for testens grænser og er O .idasenegative.

Oxidase-positive bakterier har cytochrom oxidase eller indophenol oxidase (et strygejern, der indeholder haemoprotein). Begge disse katalyserer transporten af elektroner fra donorforbindelser (NADH) til elektronacceptorer (normalt ilt)., Test reagens, N, N, N’, N’-tetramethyl-p-phenylendiamin dihydrochlorid fungerer som en kunstig elektron acceptor for enzymet oxidase. Det o .iderede reagens danner den farvede forbindelse indophenolblå.

cytokromsystemet er normalt kun til stede i aerobe organismer, som er i stand til at udnytte o .ygen som den endelige hydrogenreceptor. Slutproduktet af denne metabolisme er enten vand eller hydrogenpero .id (opdelt efter katalase).

formål/anvendelse af O .idasetest

• o .idasetesten bruges til at bestemme, om en organisme har cytokromo .idaseen .ymet.,
• testen anvendes som en støtte til differentiering af Neisseria, Moraxella, Campylobacter og Pasteurella arter (oxidase-positive).
• det bruges også til at differentiere pseudomonader fra beslægtede arter.

Procedure for Oxidase-Test

Der er mange metode variationer til oxidase-test. Disse omfatter, men er ikke begrænset til, filterpapirprøven, direkte plade metode, vatpind metode, imprægneret o .idase teststrimmel metode og reagensglas metode. Alle tider og koncentrationer er baseret på de oprindelige anbefalinger.,

Tørt papirfilter Metode

Da oxidase reagens er ustabile og har være frisk forberedt til brug, denne metode er praktisk.1 filterpapir gennemblødes i en frisklavet 1% opløsning af tertramethyl-p-phenylendiamindihydrochlorid.30 sekunder fryses strimlerne og opbevares i en mørk flaske tæt forseglet med en skruehætte.

til brug fjernes en strimmel, lægges i en petriskål og fugtes med destilleret vand.,

den koloni, der skal testes, hentes med en platinsløjfe og smøres over det fugtige område.

En positiv reaktion er angivet med en intens dyb-lilla nuance, der optræder inden for 5-10 sekunder, en “forsinket positiv reaktion med farve i 10-60 sekunder, og en negativ reaktion ved fravær af farve eller farve senere end 60 sekunder.

Vådfilterpapirmetode

1. en strimmel filterpapir gennemvædes med en lidt frisklavet 1% opløsning af reagenset.
2. en speck af kultur gnides på den med en platinsløjfe.,
3. En positiv reaktion er angivet med en intens dyb-lilla nuance, der optræder inden for 5-10 sekunder, en “forsinket positiv reaktion med farve i 10-60 sekunder, og en negativ reaktion ved fravær af farve eller farve senere end 60 sekunder.

direkte Plademetode

1. tilsæt 2 -3 dråber reagens direkte til mistanke om kolonier på en agarplade. Fyld ikke pladen med reagenset.
2. Overhold for farveændring inden for 10 sekunder.

Bemærk: metoden med direkte plade skal udføres på en ikke-selektiv agarplade.,

1. når du bruger Kovacs o .idase reagens, er mikroorganismer o .idase positive, når farven skifter til mørk lilla inden for 5 til 10 sekunder. Mikroorganismer er forsinket o .idase positive, når farven skifter til lilla inden for 60 til 90 sekunder. Mikroorganismer er O .idase negative, hvis farven ikke ændres eller det tager længere tid end 2 minutter.
2. ved brug af Gordon og McLeod-reagens er mikroorganismer o .idasepositive, når farven skifter til rød inden for 10 til 30 minutter eller til sort inden for 60 minutter. Mikroorganismer er O .idase negative, hvis farven ikke ændres.,

Podemetode

1. Dyp vatpinden i reagenset, og rør derefter ved en isoleret mistænkt koloni
2. Observer for farveændring inden for 10 sekunder.

Reagensglasmetode

1. Dyrk en frisk kultur (18 til 24 timer) bakterier i 4, 5 ml næringsstof bouillon (eller standardmedier, der ikke indeholder en høj koncentration af sukker).
2. Tilføje 0,2 ml 1% α-naphthol, derefter tilsættes 0,3 ml 1% p-aminodimethylaniline oxalat (Gaby og Hadley reagenser).
3. rystes kraftigt for at sikre blanding og grundig iltning af kulturen.,
4. Overhold for farveændringer.
5. mikroorganismer er O .idasepositive, når farven skifter til blå inden for 15 til 30 sekunder. Mikroorganismer forsinkes o .idase positive, når farven skifter til lilla inden for 2 til 3 minutter. Mikroorganismer er O .idase negative, hvis farven ikke ændres.

Fortolkning af Resultatet af Oxidase-Test

Positivt Resultat

Udvikling af en dyb lilla-blå/blå farve angiver oxidase produktion inden for 5-10 sekunder.

negativt resultat

ingen lilla-blå farve / ingen farveændring.,

Examples

Oxidase Positive Organisms: Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella, Pasteurella, Moraxella, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, etc.

Oxidase Negative Organisms: Enterobacteriaceae (e.g. E., coli)

kvalitetskontrol for Oxidase-Test

Positiv Kontrol: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Negativ Kontrol: Escherichia coli ATCC 25922

Begrænsninger af Oxidase-Test

1. De reagenser, der anvendes i oxidase-test har vist sig at auto-oxidere, så det er meget vigtigt at bruge friske reagenser, ikke ældre end 1 uge.
2. både bakterier og gær dyrket på medier indeholdende høje koncentrationer af glukose viser hæmmet o .idaseaktivitet, så det anbefales at teste kolonier dyrket på medier uden overskydende sukker, såsom næringsagar., Tryptic soja agar er også et fremragende medie.
3. bakterier dyrket på medier indeholdende farvestoffer kan give afvigende resultater.
4. testreagenserne vil effektivt dræbe mikroorganismerne, så underdyrkning bør ske inden tilsætning af reagens til en aktiv kultur.
5. o .idasetesten kan anvendes til formodende identifikation af Neisseria og til differentiering og identifikation af gram-negative baciller. O .idase-positive organismer bør undersøges ved gram-plet for at bestemme morfologi og gram-reaktion., Yderligere biokemiske test anbefales til fuldstændig identifikation.
6. anvendelse af nichrom eller andre jernholdige sløjfer kan give falsk positive reaktioner. Platin sløjfer anbefales.de fleste Haemophilus er O .idasepositive. Mindre følsomme strimler eller reagenser kan give falsk-negative resultater.
7. O .idasereaktioner af gram-negative baciller bør bestemmes på ikke-selektive og ikke-differentielle medier for at sikre gyldige resultater. Også kolonier taget fra medier indeholdende høje niveauer af glucose kan give falsk-negative reaktioner.,
8. det anbefales at bruge kolonier, der er 18-24 timer gamle. Ældre kolonier vil producere svagere reaktioner.
9. eventuelle farveændringer, der fremkommer efter 20 sekunder, bør ses bort fra.