Next generation sequencing (NGS) metoder, der er begyndt at dukke op i litteraturen i midten af 2000’erne og havde en transformerende effekt på vores forståelse af mikrobiel genetik og smitsomme sygdomme. Der er ikke desto mindre betydelig kontrovers om, hvordan, hvornår og hvor næste generations sekventering vil spille en rolle i det kliniske diagnostiske laboratorium., Et dybt dyk punkt-kontrapunkt diskussion fra Journal of Clinical Microbiology diskuterer de udfordringer og muligheder, der kan komme med indførelsen af metagenomic next generation sequencing (mNGS) i rutine laboratorier. Hvad der præcist er mNGS, og hvordan er det anderledes end de mange andre nukleinsyreteknologier derude?

Hvad er Metagenomisk næste generations sekventering?

næste generations sekventering er en af flere high-throughput sekventeringsmetoder, hvorved milliarder af nukleinsyrefragmenter kan sekvenseres samtidigt og uafhængigt., Kontrast denne teknik til klassiske metoder såsom Sanger-sekventering (også kendt som dideoxynucleotide kæde opsigelse sekventering), der behandler en nukleotid sekvens per reaktion.
for at karakterisere et bakteriegenom ved hjælp af NGS, for eksempel, er genomet opdelt i flere fragmenter, der producerer sekvenser eller læser fra hundreder til titusinder af baser i længden. Sekvenserne samles i et enkelt genom ved hjælp af beregningsmetoder. Flere overlappende sekvens læser er stykket sammen for at producere en enkelt længere sekvens kaldet en contig., Der er ofte huller mellem contigs, og selvom high-fidelity længere sekvenslæsninger ville være den ideelle metode til sekventering, platforme, der producerer kortere læsninger, er generelt billigere, og overlapningen i sekvenser gør dem mere nøjagtige. Det konstruerede genom (sandsynligvis indeholdende huller) er justeret til en referencedatabase til identifikation af organismen. Denne teknologi repræsenterer et betydeligt fremskridt i de tidlige dage af sekventering, når et enkelt bakterielt genomprojekt kan tage flere år.,
Metagenomic NGS (mNGS) er simpelthen kører alle nukleinsyrer i en prøve, som kan indeholde blandede populationer af mikroorganismer, og tildele disse til deres reference genomer til at forstå, hvilke mikroorganismer er til stede, og i hvilke proportioner. Evnen til at rækkefølge og identificere nukleinsyrer fra flere forskellige taxa, metagenomic analyse gør det en kraftfuld ny platform, der på samme tid kan identificere genetiske materiale fra helt forskellige riger organismer.,
de mulige kliniske anvendelser er enorme, herunder diagnose af infektionssygdomme, udbrud sporing, overvågning infektion kontrol, og mutation og patogen opdagelse, blandt mange andre. mNGS, undertiden kaldet haglgevær sekventering, af kliniske prøver er blevet anvendt på forskellige prøvetyper, herunder cerebrospinalvæske, blod, respiratoriske prøver, gastrointestinal væske, og okulær væske.

Hvad er Fordelene ved Metagenomic Next Generation Sequencing?,

Den største styrke mNGS er, at det er en objektiv hypotese-gratis diagnostisk metode, i modsætning til målrettet polymerase chain reaction (PCR) metoder, der er afhængige af primere til identifikation af specifikke mål at blive forstærket og registreret. Selv universal eller bredt udvalg PCR-metoder er ikke tilstrækkeligt brede til at blive betragtet som metagenomic, som de bruger specifikke primere, der er bevaret af 16S ribosom RNA (rRNA) gen og interne transcribed spacer (SIN) sekvenser til at forstærke karakteristisk nukleinsyresekvenser, der kan være bioinformatically klassificeret i bakterier/archaea, eller svampe, hhv.,
universelle primere udgør også et problem ved diagnosticering af polymikrobielle infektioner med molekylære tests. Hvis polymikrobielle populationer er til stede, når der anvendes 16S-sekventering, vil der blive foretaget flere baseopkald pr. Mens der er de-convolutional beregningsmæssige metoder til at forudsige organismer, der er identificeret, disse er ikke i standard brug for mange laboratorier, som ofte refleks til næste-generations sekventering af 16S gene for polymicrobial prøver.,

Hvad er udfordringerne ved Metagenomisk næste generations sekventering?

på trods af potentialet i mNGS er der mange barrierer at rydde, før teknologien kan blive en del af mainstream-laboratoriet, samt huller i vores forståelse af dets diagnostiske anvendelighed. Væsentlige forbehold omfatte fortolkningen af resultaterne (skelne forurening og kolonisering fra sandt patogener), udvælgelse og validering af databaser, der anvendes til analyser, og forudsigelse (eller mangel på samme) af antimikrobielle susceptibilities., En almindelig opfattelse er, at mNGS er så utroligt følsom, at det vil afsløre en diagnose, når alle andre test er negativ. Mens mNGS kan være analytisk, mere følsomme end standard dyrkning metoder i nogle tilfælde, det er nødvendigt fjernelse af store mængder af menneskelig nukleinsyre i løbet af sequencing forberedelse og beregningsmetoder) under post-analytiske proces, der kan mindske følsomheden i forhold til målrettet PCR-metoder for mange organismer.

specificiteten af mNGS forbliver den legendariske elefant i rummet., Kontaminering af prøverne under prøvetagning er en stor bekymring i betragtning af den øgede analytisk sensitivitet af mNGS i forhold til standard-kultur metoder, og der skal være en valideret kvalitetskontrol proces i stedet for skridt fra at vurdere reagens renhed til måling af tilstrækkelig genom dækning kontrol. Desuden kan de forkerte stregkodeindekser med nogle Illumina-platforme betegnes, hvilket fører til falske positiver på sekventeringsdata., Bioinformatic kvalitetskontrol for at sikre en høj kvalitet og valideret genomer er tilgængelige med minimal database fejl, og der vil ideelt set være bioinformatic personale til rådighed til at fortolke sekventering resultater for hver test, som ikke er tilgængelig på de fleste klinisk mikrobiologiske laboratorier., Federal Drug Administration (FDA) har samarbejdet med andre føderale agenturer til at kuratere en database med titlen FDA-ARGOS (FDA-database for regulering-grade mikrobielle sekvenser), som har været nyttige for at sikre, at den nuværende mNGS resultater er pålidelige og præcise, men disse ressourcer skal opdateres og vedligeholdes.
det større spørgsmål forbliver omkring den kliniske specificitet af mNGS: er de detekterede sekvenser fra patogener, der bidrager til patientens nuværende sygdom?, Den analytiske specificitet af mNGS test kan blive behandlet med streng kontrol i hele prøvetagning, sekventering bibliotek forberedelse, analyse køre, og bioinformatic klassificering, men klinisk specificitet er ikke direkte rettet af disse fremgangsmåder. Spørgsmål, der kan hjælpe med at bestemme klinisk nytte og anvendelighed omfatter: Hvordan kan vi skelne organismer relateret til forbigående bakteriæmi fra oral/gastrointestinal flora eller hud kolonisatorer i blod/plasma mngs test?, Hvordan skal sekventeringsdybde rapporteres, og hvor pålidelig er forholdet mellem sekvensdybde og ægte infektion? Er dette forhold forskelligt efter patogen / vært? Hvor lang tid er den forventede påviselige halveringstid for et patogen af mNGS, når patienten modtager passende helbredende behandling? Undersøgelser af klinisk anvendelighed og omkostningseffektivitet er meget nødvendige på trods af den ubestridelige kraft af denne teknologi fra et forsknings-og opdagelsesperspektiv.,
Det er også værd at påpege, at der er i øjeblikket ingen FDA-godkendt eller godkendt mNGS tests, der kan sendes til mikrobielle undersøgelser, selv om der ikke er laboratorier, der er godkendt i henhold til Kliniske Laboratorier Forbedring Ændringer af 1988 (CLIA ’88), der tilbyder testning af kliniske prøver. Til dato er kun få diagnostiske NGS-systemer blevet ryddet af FDA til onkologisk test eller påvisning af cystisk fibrose, for eksempel., En nylig gennemgang beskriver detaljeret mange af de lovgivningsmæssige forhindringer og overvejelser, der skal løses, før mngs kunne komme ind i mainstream kliniske diagnostiske laboratorier som en FDA-valideret test.
sammenfattende, mens mngs-test sandsynligvis kan spille en vigtig rolle i den mikrobiologiske diagnostiske arbejdsgang i fremtiden, især da sekventering og bioinformatisk processorkraft udvikler sig, forbliver dette en højkompleksitetsteknologi, som det kliniske værktøj i vores nuværende medicinske praksismiljø forbliver usikkert., Selvom mngs-test kan tilbyde nye og spændende diagnostiske kliniske muligheder i den nærmeste fremtid, vil intet af det sandsynligvis erstatte en skarp kliniker når som helst snart.