Design af syntetiske acetyl-CoA vej
Den enkleste måde at syntetisere organiske kulstof fra ét-carbon-er at konstruere det en efter en., For at opbygge en kunstig acetyl-CoA vej fra en kulstof, som vi foreslog i den Syntetiske Acetyl-CoA (SACA) pathway, hvor to molekyler af formaldehyd ville blive overført til et molekyle af acetyl-CoA gennem tre trin (Fig. 1a). For det første kondenseres formaldehyd til glycolaldehyd (GALD) af glycolaldehydsyntase (GALS). Og derefter omdannes glycolaldehyd til acetylphosphat (AcP) af acetylphosphatsyntase (ACP ‘ er) under anvendelse af uorganisk phosphat. Endelig vil AcP blive anvendt til fremstilling af acetyl-CoA ved den kendte en .ymphosphatacetyltransferase (PTA)25., I mellemtiden kan formaldehyd opnås ved at reducere kuldio .id og formiat26 eller O .idere methan og methanol27. Således kunne vi realisere biosyntesen af acetyl-CoA fra formaldehyd og endda andre en-kulstofressourcer.
Beskrivelse og numerisk analyse af SACA vej. a SACA-vejen blev fremhævet i det røde panel. Det vigtigste råmateriale af formaldehyd kunne være fra methanol, formiat og endda metan og CO2., Produktet af acetyl-CoA kunne bruges til at generere vigtige cellulære næringsstoffer. b termodynamiske data for tre designet veje til acetyl-CoA syntese blev genereret af den hjemmeside for eQuilibrator (http://equilibrator.weizmann.ac.il)., ΔrG er: den samlede Gibbs energi forandring; Trin: antallet af reaktioner fra formaldehyd til acetyl-CoA i de undersøgte veje; MDF: den maksimale drivende kraft; Udbytter: det samlede udbytte af kulstof i de undersøgte veje; Coenzymer: antallet af coenzymer er anvendt i de undersøgte veje
termodynamik kan afspejle, om en vej kunne være gennemført i vivo eller in vitro. Vi beregnede den termodynamiske kemiske drivkraft for den designede SACA-vej., Den samlede reaktion fra formaldehyd til acetyl-CoA er meget termodynamisk gunstig, hvor den samlede Gibbs energiændring (rgrg’ m) af hele reaktionen er omkring -96.7 kJ mol−1 (fig. 1b og supplerende tabel 1). Værdien af MDF (maksimal drivkraft) bruges normalt til at evaluere den termodynamiske og kinetiske kvalitet af forskellige stier28. Hvis MDF er tilstrækkelig høj, indeholder vejen ingen termodynamiske flaskehalse, der ville hæmme dens drift in vivo. SACA-vejen opnåede den relativt høje MDF-værdi på 26.,9 kJ mol-1, hvilket naturligvis er højere end FLS−og MCC-veje (deres MDF-værdier er henholdsvis 1.9 og 5.8 kJ mol-1). Derfor er SACA-vejen termodynamisk gunstig for biosyntesen af acetyl-CoA fra formaldehyd.
Identifikation af et nyt enzym fra C1 til C2
kondensering af formaldehyd kan være katalyseret af N-heterocykliske karabin i chemistry29,30. I biologi har Thia .oliumringen af cofaktoren thiamindiphosphat (ThDP) en lignende funktion, som kunne aktivere et aldehyd og derefter danne dimer med en anden aldehyd31., For at finde et enzym til at kondensere to molekyler af formaldehyd i et molekyle af glykolaldehyd, vi henvist til den katalytiske mekanismer ThDP-afhængige enzymer og konstrueret en theozyme model, som omfatter ThDP, glykolaldehyd, og glutaminsyre, der giver elektron for reaction32 (Fig. 2a). Alle en .ymer i Protein Data Bank (PDB) blev næsten screenet baseret på Theo .yme-modellen, og 37 ikke-redundante proteinstrukturer med ligand ThDP blev opnået (supplerende Fig. 1 og supplerende bemærkning)., Ifølge de katalytiske mekanismer af ThDP-afhængige en .ymer33,34, 35 er C2 atom i ThDP det aktive center. Afstanden mellem C2-atom og produktet af glycolaldehyd er kritisk for at udløse den katalytiske reaktion (fig. 2a). Således analyserede vi afstanden mellem C2 atom og glycolaldehyd i hvert kandidatprotein.
Theozyme model konstruktion og funktionel identifikation af glykolaldehyd-syntase., a theo .yme model interaktion mellem glycolaldehyd og de aktive centre af forskellige ThDP-afhængige en .ymer. Glutamatet (glu) er tan; glycolaldehyd er cyan; ThDP er grøn. Afstanden mellem C2 atom i ThDP og glycolaldehyd carbonatomer er repræsenteret ved d1 og d2. Den grønne prik er magnesiumion. b de gennemsnitlige afstande (blå) mellem D1 og d2 i hvert protein er vist til venstre. Mængden af produkt (gul) for det testede protein er vist til højre. Reaktionen blev udført ved tilsætning af 1 mg mL−1 af de testede proteiner og 2 g L−1 formaldehyd. Nd ingen afsløring., Fejlstænger repræsenterer s. d. (standardafvigelse), n = 3. C proteinekspression af tre funktionelle kandidater ved anvendelse af 1 mL 1 OD-celler. M: protein markør; 1, 3 og 5 repræsenterer protein udtryk uden IPTG til 2UZ1, 3FZN, og 4K9Q, henholdsvis 2, 4, og 6 repræsenterer protein udtryk under IPTG inducerende for 2UZ1, 3FZN, og 4K9Q, henholdsvis; De røde pile peger på protein bands for 2UZ1, 3FZN, og 4K9Q, hhv. Kildedata leveres som en Kildedatafil.,
Baseret på de gennemsnitlige afstande i hvert protein ved hjælp af molekylær docking (Supplerende Data, 1)36, seks kandidater med korte afstande og klare funktionelle anmærkninger, der blev defineret som kandidater (Fig. 2b og supplerende tabel 2). Derudover blev tre proteiner med lange afstande tilfældigt valgt som kontroller. Kandidaterne og kontrollerne blev udtrykt og renset for at teste deres evne til at producere glycolaldehyd fra formaldehyd., Tre ud af seks kandidater udviste den ønskede aktivitet, mens tre kontroller ikke havde funktionen, hvilket indikerer afstanden mellem C2-atom og glycolaldehyd spiller en kritisk rolle for kondensationen af formaldehyd. Blandt tre aktive kandidater, protein 2UZ1 (https://www.rcsb.org/structure/2UZ1), der blev betegnet som benzaldehyd lyase (BAL), blev rapporteret til fortrinsvis at generere dihydroxyacetone (DHA), der på trods af den minimale udbytte af glykolaldehyd, når koncentrationen af formaldehyd var lower37., The other two proteins 3FZN (https://www.rcsb.org/structure/3FZN) and 4K9Q (https://www.rcsb.org/structure/4K9Q) that produce glycolaldehyde from formaldehyde were named as benzoylformate decarboxylases (BFD) in PDB database. And BFD (3FZN) from Pseudomonas putida was selected as candidate for subsequent modification since it has higher activity and expression level (Fig. 2c).,
Dirigeret evolution af glykolaldehyd-syntase
Siden BAL var blevet manipuleret til at producere DHA fra formaldehyde22, vi har foreslået til at opdage, hvis den tilsvarende mutationer i BFD vil også bidrage til at forbedre enzym aktivitet (Supplerende Fig. 2). Ved screening af alle muterede rester fandt vi faktisk en meget aktiv mutation .86r-N87T, som var placeret i substratkanalen i BFD (supplerende fig. 3). Således blev denne mutation (.86r-n87t) indført i BFD, og varianten blev markeret som M1., For yderligere at forbedre den katalytiske aktivitet af BFD, vi foreslog at skærmen alle rester omkring det aktive centrum af BFD, hvor 25 positioner inden for 8 Å afstand fra det aktive center blev valgt for at gøre single-point mætning mutagenese (Supplerende Fig. 4). Vi har udviklet et high-throughput screening fremgangsmåde til påvisning af glykolaldehyd-farve reaktion mellem glykolaldehyd-og diphenylamin, som blev målt ved spectrophotometrically skærm på 650 nm (Supplerende Fig. 5)., Efter screening fandt vi, at 14 ud af 25 positioner viste højere aktiviteter end M1-mutant (supplerende fig. 6). Efterfølgende, 14 positioner blev inddelt i 8 grupper: A (N27/G402), B (N27/S236), C (N27/A460), D (F397/C398), E (L 109/L110), F (H281/Q282), G (N374/S378), og H (T379/T380). N27 blev brugt tre gange, da varianterne i denne position viste den højeste aktivitet. Ved hjælp af M1 som skabelon introducerede vi hver gruppe af mutationer i M1 og valgte den højeste aktive mutant, som blev mærket som M2., Ved at udføre tre runder af iterativ kombinatorisk mutagenese blandt disse positioner screenede vi fuldstændigt 64,512 kloner og opnåede en mutant med høj aktivitet, der indeholder fem nye mutationer omkring det aktive center. Endelig blev varianten med 7 restmutationer navngivet som glycolaldehydsyntase (GALS). Kcat af GALS blev forbedret omkring 160 gange, og den endelige katalytiske effektivitet af GALS er 9.6 M-1 * s-1, hvilket er omtrent 70 gange end starten .ymet (fig. 3a og supplerende Fig. 7).
Protein engineering og mekanisme analyse af glykolaldehyd-syntase. en kinetisk parametre for WT og mutanter. VÆGT: wild-type; M1: mutationer i W86R og N87T; M2: mutationer i W86R, N87T, L109G, og L110E; M3: mutationer i W86R, N87T, L109G, L110E og A460M; M4: mutationer i W86R, N87T, L109G, L110E, A460M, H281V, og Q282F. b oversigt over de udvalgte fem mutationer i det aktive center. IMA: mellemanalog; de orange linier angiver hydrogenbindingerne mellem hydro .ylgruppen af IMA og mutationen L110E., C lommemængderne M1, M2, M3 og M4. Lyserøde prikker repræsenterer bindingslommerne (supplerende Data 2), som er henholdsvis 131.25, 161.50, 133.38 og 171.38 Å3. Tallene blev gengivet ved hjælp af UCSF Chimera soft .areversion 1.1246. Kildedata leveres som en Kildedatafil.
for at finde ud af, hvordan disse mutationer forbedrer en .ymaktiviteten, foreslog vi at gentage krystallisation af GALS. Den aktive lomme lokaliserer ved grænsefladen til homodimer af GALS38., Proteinstrukturen af GALS kan afvige fra startproteinet efter flere runder af mutation. Her krystalliserede vi proteinet fra GALS og hentede krystalstrukturen af GALS ved hjælp af strukturen af bfd som søgemodel (supplerende tabel 3). Krystalstrukturen af GALS blev analyseret (supplerende Fig. 8, Supplerende Fig. 9). Vi fandt, at den mutation af L110E introducerer yderligere to hydrogenbindinger til hydroxyl gruppe af mellemliggende analog (IMA), der kan bidrage til at stabilisere transition state og spalte C–C binding mellem produkt og cofaktor ThDP (Fig. 3b)., Mutationen af l109g forstørrede volumenet af substratbindingslomme ved at erstatte den store isobutylgruppe med en brintgruppe. Den tredje mutation af A460M kan omorientere substratet og derefter øge interaktionen mellem ThDP og substrat. De sidste to mutationer H281V og and282f udvidede poreradius udvendig overflade og kan lette adgangen for substrat eller produkt (fig. 3c). Sammenligning med M1 blev volumenet af reaktionslomme i GALS forstørret mere end 30%, hvilket ville være hovedårsagen til forbedringen af katalytisk aktivitet.,
identifikation af acetyl-phosphatsyntase
i naturen blev der ikke rapporteret noget en .ym for at opnå syntesen af AVS fra glycolaldehyd. Phosphoketolaser (PKs) kan producere AVS fra fructose-6-phosphat (F6P)eller 5ylulose-5-phosphat (.5p) 39. I henhold til den katalytiske mekanisme af PKs, det er muligt, at glykolaldehyd interagerer med ThDP og derefter genererer 2-α -, β-dihydroxyethylidene-ThDP (DHEThDP) (Fig. 4a), som er det vigtigste mellemprodukt til dannelse af AVS fra F6P eller .5p af PKs. For at bekræfte vores hypotese valgte vi otte kandidater (Fig., 4b) baseret på det fylogenetiske træ af PKs fra 111 bakteriefamilier (supplerende Fig. 10). Efter gensyntese og proteinrensning (supplerende fig . 11) undersøgte vi den katalytiske aktivitet af alle kandidatproteiner ved anvendelse af glycolaldehyd som substrat. Heldigvis viste fem ud af otte PKs betydelige katalytiske aktiviteter. Kun PK1, PK4 og PK8 viste ikke signifikant forskel fra den tomme kontrol. Således blev PK2 med den højeste aktivitet betegnet som acetyl-phosphatsyntase( ACPS), hvis kcat/Km opnår 3,21 m−1·s−1 (supplerende fig. 12).,
Numerisk analyse og funktionel identifikation af acetyl-fosfat-syntase. a dannelsen af DHEThDP fra F6P /55p og glycolaldehyd. De faste pile repræsenterer dhethdp ‘ s formationsmekanisme i ref. 39; de stiplede pile angiver den forudsagte proces ved anvendelse af glycolaldehyd som substrat. B identifikation af ACP ‘ er. Den maksimale sandsynlighed fylogenetiske træ af de udvalgte otte PKs blev konstrueret af MEGA47., Detaljerne for de valgte PKs er til stede i den supplerende note og supplerende Fig. 10. Aktiviteten af hvert protein blev påvist ved tilsætning af 0,5 mg mL−1 en .ym og 10 mM glycolaldehyd. Avs-acetyl-fosfat, PK phosphoketolase, Produktion af Avs – (μ mol min−1 mg−1): mængden af Avs-produceret per mg enzym i minuttet; Kontrol: ingen enzym, der blev tilføjet i den reaktion system; Fejl søjler repræsenterer s.d. (standardafvigelse) n = 3. c energiprofilen for dhethdp-dannelsesprocessen., IM1 og IM2 repræsenterer mellemliggende 1 og 2 under dannelsesprocessen; TIM repræsenterer det tautomeriserede mellemprodukt mellem IM1 og IM2; TS1 og TS2 repræsenterer overgangstilstandene. Kildedata leveres som en Kildedatafil.
for At afsløre den mekanisme, der danner DHEThDP fra glykolaldehyd, vi har foreslået til at udføre teoretisk analyse, der er baseret på det foregående computermodel af PK40. Alle mulige aminosyrer relateret til dannelsen af dhethdp blev anvendt til at konstruere beregningsmodellen (supplerende fig. 13)., Baseret på beregningsmæssig simulering fandt vi, at energibarrieren kun er 11,36 kcal mol−1 til dannelse af IM1 (mellemliggende 1), når glycolaldehyd blev protoneret af his553, hvilket blev betragtet som den mest mulige protondonor40 (fig. 4c). Derefter tautomeri .es IM1 til IM2 ved hjælp af Glu479 og Glu437. IM2 er energisk mere stabil end IM1. Når protonen af IM2 blev fjernet af N4 ‘ i ThDP, er energibarrieren fra IM2 til den centrale mellemliggende dhethdp 15.,13 kcal mol-1, som er lige så ens som belastningsenergien under dannelsen af DHEThDP under anvendelse af F6P som substrat40. Efter dannelsen af dhethdp er de følgende katalytiske processer de samme som andre PKs (supplerende Fig. 14), hvilket vil sige, H97 fungerer som proton donor af tørringen af DHEThDP, og His142 og Gly155 fremskynde tørringen af DHEThDP, at dømme ud fra det faktum, at His142 og Gly155 danner hydrogenbindinger med vand molekyle i struktur efter dehydrering mellemliggende (AcThDP)., His64, Tyr501 og asn549 er vigtige for det nukleofile angreb fra Pi, og de udgør tilsammen bindingsstedet for Pi39. Stedrettede mutageneseforsøg indikerede også, at disse rester er afgørende for en .ymaktivitet (supplerende fig . 15).
Syntese af acetyl-CoA fra formaldehyd in vitro
Med den første vellykkede design af GALS og AVS-landene, vi er bestemt til at konstruere SACA pathway in vitro til at syntetisere acetyl-CoA fra formaldehyd. For det første målte vi udbyttet af glycolaldehyd af GALS under forskellige koncentrationer af formaldehyd., Resultaterne viste, at GALS effektivt kan katalysere dimerisationen af formaldehyd, og udbyttet af glycolaldehyd steg med koncentrationen af substrat forbedret (fig. 5a). For eksempel steg udbyttet af glycolaldehyd fra formaldehyd fra 45% ved 0,5 g L-1 til 80% ved 2 g l−1. For det andet undersøgte vi den katalytiske effektivitet fra glycolaldehyd til AVS, som blev kvantificeret ved indholdet af eddikesyre, da AVS hurtigt ville blive nedbrudt til eddikesyre (supplerende Fig. 16)23., Resultaterne viste, at udbyttet af AVS nåede op på mere end 80% under forskellige koncentrationer af glycolaldehyd via ACP ‘ er (supplerende fig. 17). Desværre blev ACPS åbenlyst hæmmet af formaldehyd (Fig. 5b). Det er således nødvendigt at tage en balance for koncentrationen af formaldehyd i løsningen af denne konflikt.
der Bekræfter biosyntesen af acetyl-CoA fra formaldehyd ved SACA pathway in vitro. en syntese af glycolaldehyd fra formaldehyd af GALS., Reaktioner blev udført under forskellige formaldehydkoncentrationer med 2 mg mL-1 oprenset GALS ved 37 C C i 2 timer. B inhiberingen af ACPS ved formaldehyd. Udbyttet af eddikesyre blev målt på forskellige tidspunkter med reaction buffer, 2 mg mL−1 AVS-landene, 0,75 g L−1 glykolaldehyd-og gradienten af formaldehyd fra 0 til 2 g L−1, som var repræsenteret ved forskellige farver linjer. C udbytte af eddikesyre fra forskellige formaldehydkoncentrationer. Reaktionerne blev udført ved 37 C C natten over med reaktionsbuffer, 2 mg mL−1 GALS, 2 mg mL−1 ACPS og gradienten af formaldehyd fra 0.,5 til 2 g L-1. d udbytte af eddikesyre eller acetyl-CoA fra 1 g l-1 formaldehyd. Udbyttet af eddikesyre eller acetyl-CoA blev målt på forskellige tidspunkter. Den blå linje repræsenterer den reaktion system til at producere acetyl-CoA (med 20 mM CoA fodring og indeholder 2 mg mL−1 af renset GALS, AVS-landene, og PTA, henholdsvis); den orange linje repræsenterer den reaktion system til at producere eddikesyre (indeholder 2 mg mL−1 GALS og AVS-landene og uden CoA fodring). Prøver i alle assays blev analyseret af HPLC. Fejlstænger repræsenterer s. d. (standardafvigelse), n = 3., Kildedata leveres som en Kildedatafil.
for at optimere koncentrationen af formaldehyd, en gradient eksperimentet blev udført ved hjælp af den reaktion system, der indeholder 2 mg mL−1 af GALS og AVS-landene. Ved forøgelse af koncentrationen af formaldehyd steg udbyttet af eddikesyre i systemet oprindeligt og faldt derefter (fig. 5c). Når koncentrationen af formaldehyd er 1 g L-1, nåede udbyttet af eddikesyre til 50,6%., Interessant nok er det endelige udbytte af eddikesyre endnu højere end det i reaktionssystemet fra glycolaldehyd til AVS med samme mængde formaldehyd (fig. 5b, grå linje). Dette ville være forårsaget af delvis frigivelse af ACPS-funktionen, da formaldehyd gradvist blev konsumeret af GALS. Baseret på dette system tilføjede vi yderligere en anden kendt en .ymphosphatacetyltransferase (PTA), som ville omdanne AVS til acetyl-CoA. Endelig frembragte SACA-vejen 5,5 mM acetyl-CoA ved formaldehydkoncentrationen på 1 g L-1. Udbyttet af acetyl-CoA fra formaldehyd var omkring 33% (fig. 5d)., Udbyttet af eddikesyre (7,8 mM) fra formaldehyd (33,3 mM) nåede imidlertid til 50%, hvis PTA og CoA ikke blev leveret. Det lavere udbytte af acetyl-CoA end af eddikesyre ville være forårsaget af ustabiliteten af acetyl-CoA og AcP. Vores resultater indikerede, at det er vellykket for biosyntesen af acetyl-CoA fra formaldehyd ved SACA-vejen in vitro.,
Validering af SACA vej, 13C-mærkning
Efter at afdække SACA vej med renset enzymer in vitro, vi endvidere forsøgt at teste biosyntesen af acetyl-CoA, og det er produkter fra SACA pathway in vivo ved 13C-metaboliske tracer-analyser (Fig. 6a). For det første blev cellelysater anvendt til at verificere biosyntesen af acetyl-CoA ved tilsætning af 13C-mærket formaldehyd og CoA. Vi opdagede signifikant stigning af den dobbelte 13C-mærkede acetyl-CoA end andre kontroller (P-værdi < 0.001, t-test) (fig. 6b og supplerende Fig. 18)., Endvidere forsvandt forøgelsen af dobbelt 13C-mærket acetyl-CoA, hvis vi udeladte et af gener i SACA-vejen, såsom ACPS og PTA (supplerende Fig. 19). Derudover ville acetyl-CoA konvergeres med o .aloacetat for at komme ind i tricarbo .ylsyrecyklussen (TCA). Vi har også fundet væsentligt mere dobbelt 13C-mærket fumarate (P-værdi < 0.001, T-test) og malat (P-værdi < 0.001, T-test) kun i stamme med SACA vej og 13C-mærket formaldehyd fodring (Fig. 6b og supplerende Fig. 18)., Imidlertid, vi ikke påvise signifikante forskelle i højere orden masse isotopomerer. Det ville være forårsaget af den lave mængde dobbelt 13C-mærkede isotopomerer i TCA-cyklussen.
13C-mærket metaboliske sporstof analyse af SACA vej. et skematisk diagram af den testede vej for 13C-mærket sporstof. B fraktionen af M + 2 forbindelser i cellulære lysater med 13C-mærket eller umærket formaldehyd. C fraktionen af 13C-mærkede metabolitter., Celler blev induceret i LB og overført til M9 medium indeholdende 13C-mærket methanol. Intracellulære metabolitter blev påvist efter inkubation på 16 timer, og proteinogene aminosyrer blev målt efter inkubation på 26 timer. Summen af de detekterede isotopomerer blev sat til 100%., 13C-FALD 13C-mærket formaldehyd, m – + 0 uden 13C mærkning, m + 1 enkelt 13C mærkning, m + 2 dobbelt 13C mærkning, FALD formaldehyd, Acetone, methanol, GALD glykolaldehyd, Avs-acetyl-phosphat -, Asp-aspartat, Glu glutamat, PEP phosphoenolpyruvate, SACA stammen indeholder vektor GALS-AVS-PTA-28a, 28a stammen indeholder den tomme vektor af 28a, BsMDH-SACA stammen indeholder både BsMDH-pCDF og GALS-AVS-PTA-28a vektorer, BsMDH-28a: stammen indeholder både BsMDH-pCDF vektor og den tomme vektor 28a. Fejl søjler repræsenterer s.d. (standardafvigelse) n = 3., Kildedata leveres som en Kildedatafil.
efterfølgende foreslog vi at teste kulstofstrømmen i celler. På grund af toksicitet af formaldehyd til celler, vi har indført methanol dehydrogenase fra Bacillus stearothermophilus (BsMDH)41 for at opretholde en konstant lav koncentration af formaldehyd i vivo (Fig. 6a). De dyrkede celler blev høstet på forskellige tidspunkter og blev brugt til at detektere proteinogene aminosyrer og intracellulære metabolitter (fig. 6c)., Vi fandt, at stammen med SACA-vejen (bsmdh-SACA) indeholdt mere dobbelt 13C-mærket aspartat og glutamat, som stammede fra TCA-cyklussen. Hertil kommer, at de 13C-mærket glucose og phosphoenolpyruvate, som kan generere fra dobbelt-13C-mærket oxaloacetate gennem glukoneogenese ved vejen, blev fundet mere i den stamme BsMDH-SACA end dem, der er i kontrol-stamme (BsMDH-28a). Således viste vores resultater, at SACA-vejen er funktionel til fremstilling af acetyl-CoA og acetyl-CoA-afledte metabolitter fra formaldehyd.,
evaluering af SACA-vejen ved cellevækst
For yderligere at evaluere SACA-vejen in vivo foreslog vi at teste cellevæksten trinvist ved at fodre hvert mellemprodukt i vejen. Oprindeligt voksede E. coli op under det rige medium, og derefter blev glycolaldehyd tilsat som supplerende carbonkilde. Ved tilsætning af forskellige koncentrationer af glycolaldehyd (supplerende fig. 20), fandt vi, at den konstruerede stamme, der indeholder SACA-vejen med mere end 0.,4 g l-1 glycolaldehydforsyning har bemærkelsesværdig højere OD600 end de stammer uden glycolaldehyd eller SACA-vejen (Fig. 7a og supplerende fig. 21). Bidraget af glycolaldehyd til biomasse (cellulær tørvægt, CD.) var 0,681 ± 0,028 GCD .g−1 (n = 3) glycolaldehyd.
vurdering af SACA-vejen ved cellevækst. en cellevækst assays under anvendelse 0,4 g l-1 glycolaldehyd som supplerende carbonkilde., B – cellevækstanalyser ved hjælp af 80 mg l-1 formaldehyd som supplerende carbonkilde. C Cellevækstanalyser ved anvendelse af 8 g l-1 methanol som supplerende carbonkilde. Celler blev oprindeligt dyrket i LB-medium. IPTG blev tilsat for at inducere proteinekspression, og derefter blev de supplerende carbonkilder tilsat. OD600 blev påvist på forskellige tidspunkter., SACA stammen indeholder vektor GALS-AVS-PTA-28a, 28a stammen indeholder den tomme vektor af 28a, BsMDH-SACA den stamme, som omfatter både BsMDH-pCDF og GALS-AVS-PTA-28a vektorer, BsMDH-28a stammen indeholder både BsMDH-pCDF vektor og den tomme vektor 28a, Ingen GALS den stamme, der indeholder alle gener i vejen, bortset fra GALS, + tilføjelse af supplerende kulstof kilde, − uden supplerende kulstof kilde, glykolaldehyd (GALD), formaldehyd (FALD), methanol (MeOH). Fejlstænger repræsenterer s. d. (standardafvigelse), n = 3. Kildedata leveres som en Kildedatafil.,
Når vi testede cellevækst under anvendelse af formaldehyd som supplerende carbonkilde, blev væksten af stammen med Tom vektor fuldstændigt hæmmet af 80 mg L−1 formaldehyd (fig. 7b). Stammen indeholdende SACA-vejen blev oprindeligt hæmmet og voksede derefter normalt op under den samme tilstand, hvilket kan være forårsaget af dens hurtigere hastighed af formaldehydforbrug end stammen med Tom vektor (supplerende fig. 22)., Desværre havde stammen indeholdende SACA-vejen ikke mere biomasse med tilskud af formaldehyd end dem uden formaldehyd. Disse resultater indikerede, at selv om SACA-vejen er mere effektiv til fjernelse af det giftige formaldehyd, er det ikke nok at tilvejebringe biomasse.
endelig havde vi til hensigt at evaluere SACA-vejen ved at fodre methanol, som kontinuerligt ville blive omdannet til formaldehyd. Vi fandt, at stammen, der indeholder både BsMDH og SACA-vejen, har højere OD600 end disse kontroller uden methanolforsyning eller SACA-vejen (Fig. 7c og supplerende Fig., 23). Efter 26 h inkubation fandt vi, at værdien af OD 600 i stammen indeholdende både BsMDH og SACA-vejen steg omkring 0,2, hvilket er signifikant højere end stammen uden SACA-vejen (P-værdi = 0,005, T-test). Ved at sammenligne med stammen uden SACA-vejen fandt vi, at mængden af biomasse afledt af methanol var 0,03 0.00 0,006 GCD.G−1 (n = 3) methanol i stammen, der indeholder SACA-vejen.