Den genetiske forbindelser mellem DNA-reparation af veje og menneskelige kræft disposition har næret interesse i de proteiner, der genkender og reparation specifikke områder af DNA-skader. Reparationsen .ymerne er bemærkelsesværdigt bevaret fra bakterier til svampe til mennesker, hvilket understreger præmien for at opretholde genomisk integritet i lyset af en mutagen byrde., DNA er modtageligt for skader forårsaget af fejl begået under replikation og af miljømæssige faktorer, såsom stråling, o .idanter eller alkyleringsmidler. Reparationsreaktioner involverer udskæring af kemisk ændrede eller forkert parrede baser fra DNA-duple .et. Resulterende huller udfyldes af DNA-polymeraser; denne reaktion efterlader et nick ved eller flankerer reparationsstedet. En analog proces forekommer under kromosomal DNA-replikation, hvorved de 5′-RNA-segmenter, der Primer diskontinuerlig syntese af Oka .aki-fragmenter, udskæres, og de mellemliggende huller udfyldes af DNA-polymerase.,

DNA-reparations-og replikationsveje konvergerer på et fælles sidste trin, hvor kontinuiteten af den reparerede DNA-streng gendannes ved DNA-ligase, et en .ym, der omdanner nicks til phosphodiesterbindinger. Nicks er potentielt skadelige DNA-læsioner, der, hvis de ikke korrigeres, kan give anledning til dødelige dobbeltstrengsbrud. Følgelig er det totale tab af DNA-ligasefunktion dødelig.

DNA-Ligasereaktion

DNA-ligaser katalyserer sammenføjningen af en 5′-phosphat-termineret streng til en 3′ – hydro .yl-termineret streng., Ligation afhænger af magnesium og en højenergi cofaktor, enten ATP eller NAD+. Reaktionsmekanismen involverer 3 sekventielle nukleotidyloverførselsreaktioner. I det første trin, nucleophilic angreb på alpha-fosfor af ATP (adenosin trifosfat), eller NAD+ (nicotinamid adenin dinucleotide) ved ligase resulterer i frigivelse af pyrofosfat eller NMN (nicotinamid mononucleotide) og dannelsen af en kovalent mellemliggende (ligase-adenylate) i hvilken AMP der er forbundet via en phosphoamide (P-N) obligation til epsilon-amino gruppe af lysin., I det andet trin overføres forstærkeren til 5 ‘- enden af den 5 ‘ – phosphat-terminerede DNA-streng for at danne DNA-adenylat-en inverteret pyrophosphatbrostruktur, AppN. I denne reaktion angriber 5’-phosphat-o .ygen i DNA-strengen fosforet af ligase-adenylat; lysin-sidekæden på det aktive sted er den forlader gruppe. I det tredje trin katalyserer ligase angreb fra 3 ‘ – OH af nick på DNA-adenylat for at slutte sig til 2 polynukleotider og befri AMP.

fylogenetisk Distribution

levende organismer omfatter 3 domæner: eubakterier, archaeabakterier og eukaryoter., Alle organismer koder for 1 eller flere DNA-ligaser. Den ligaser er inddelt i 2 familier, ATP-afhængige ligaser og NAD+-afhængige ligaser, i henhold til bestemmelse af substrat, der kræves for ligase-adenylate dannelse. ATP-afhængige DNA-ligaser findes i alle 3 domæner. NAD + – afhængige DNA-ligaser (LigA) er allestedsnærværende i bakterier, hvor de er essentielle for vækst og præsenterer attraktive mål for antiinfektiv lægemiddelopdagelse. NAD+ – afhængige ligaser findes kun sporadisk uden for livets bakteriedomæne, f, , og visse DNA-vira, og blev formodentlig erhvervet i disse ta .a ved vandret genoverførsel.

Eukaryote Cellulære ATP-afhængige Ligaser

ATP-afhængige DNA ligaser findes i alle eukaryote arter. Pattedyrceller indeholder fire DNA-ligase ISO .ymer. Aminosyre-sekvens sammenligninger tyder på, at en kerne katalytiske domæne, der er fælles for alle ATP-afhængige ligaser er udsmykket med yderligere isoenzym-specifikke domæner som ligger på amino eller carboxylgrupper termini af proteiner., Det menes, at disse flankerende segmenter medierer bindingen af pattedyrs DNA-ligaser til andre proteiner involveret i DNA-replikation, reparation og rekombination. Pattedyr isozymes er nævnt som ligase jeg, ligase, IIIa, ligase, IIIb, og ligase IV. DNA-ligase, jeg er en 919-aminosyre polypeptid, der er udtrykt i alle væv, som katalyserer sammenføjning af Okazaki-fragmenter under DNA-replikation og det spiller også en rolle i DNA-reparation., DNA ligaser IIIa (922 aminosyrer) og IIIb (862 aminosyrer) er produkter af et enkelt gen; de adskiller sig i aminosyresekvensen kun på deres etage termini som en konsekvens af alternativ mRNA splejsning. Ligase IIIa udtrykkes allestedsnærværende og er impliceret i DNA-reparation og er afgørende for mitokondriel funktion. Ligase IIIb-ekspression er begrænset til testis, specifikt til spermatocytter, der gennemgår meiose. DNA ligase IV er et 911-aminosyrepolypeptid, der spiller en rolle i reparationen af dobbeltstrenget DNA-pauser via ikke-homolog slutforbindelse (NHEJ).,

gærceller indeholder 2 separat kodede DNA-ligaser, som er homologe med henholdsvis pattedyrs DNA-ligaser i og IV. DNA-ligasen i (Cdc9p) af den spirende gær Saccharomyces cerevisiae er afgørende for cellevækst. Genetiske eksperimenter implicerer ligase I i forsegling af Oka .aki fragmenter og i færdiggørelsen af DNA e .cision reparation. I modsætning hertil er gær-DNA-ligase IV ikke afgørende for cellevækst. Imidlertid fremkalder deletion af LIG4-genet fænotyper, der indikerer, at ligase IV katalyserer reparationen af dobbeltstrengsbrud i den ikke-homologe slutforbindelsesvej (NHEJ)., Spirende gær har tilsyneladende ingen homolog af pattedyr DNA-ligase III.

Viral ATP-Afhængige DNA Ligaser

Bakterielle DNA-vira, såsom E. coli bacteriophages T4, T6, T7, og T3, kode deres egen ATP-afhængige DNA ligaser. ATP-afhængige DNA-ligaser kodes også af eukaryote DNA-vira, der udfører nogle eller hele deres replikationscyklus i cytoplasmaet. Disse omfatter vacciniavirus, afrikansk svinepestvirus og Chlorella virus PBCV1. Bakteriofagen og eukaryote virale DNA-ligaser er mindre end deres cellulære modstykker., Vaccinia DNA-ligase, en 552-aminosyre polypeptid, er forbavsende ens på aminosyre-sekvens-niveau for at pattedyr DNA-ligase III. Ja, ligase III er mere tæt knyttet til vaccinia ligase, end at pattedyr ligaser i og IV. Den ligaser af T4 (487 aminosyrer), T7 (359 aminosyrer), T3 (346 aminosyrer), og Chlorella-virus (298 aminosyrer) er mindre. Vi har vist, at Chlorella virus ligase kan supplere væksten af en gær stamme, hvor DNA ligase i gen er blevet slettet., Dette resultat antyder, at proteinsegmenterne, der er unikke for den meget større DNA-ligase I, ikke er essentielle for gærcellevækst.

Nick-Sensing ved DNA-ligaser

Vi har undersøgt interaktionen mellem eukaryote ligaser og DNA ved hjælp af viruskodede en .ymer som modeller. Vaccinia virus-DNA ligase, og Chlorella virus-DNA ligase, hver danner en diskret kompleks med en enkeltvis hakker DNA-ligand i mangel af magnesium, der kan løses fra gratis DNA ved native polyacrylamid gelelektroforese., Den virale ligaser ikke danne stabile komplekser med følgende ligander: (i) DNA, der indeholder en 1-nukleotid-eller 2-nukleotid hul; (ii) den forseglede duplex DNA-produkt af ligation reaktion; (iii) en enkeltvis hakker duplex indeholder en 5′-OH endestation ved nick i stedet for en 5′-phosphat; eller (iv) en enkeltvis hakker duplex indeholder en RNA-streng på 5′-phosphat side af nick (10 til 15). Således har virale ATP-afhængige DNA-ligaser en iboende nick-sensing-funktion.,

Nick anerkendelse af vaccinia DNA-ligase, og Chlorella virus-DNA ligase også afhænger af belægning af AMP bindende lomme på enzym — dvs, mutationer af ligase aktive site at afskaffe evne til at danne ligase-adenylate mellemliggende også fjerne nick anerkendelse; der henviser til, at en mutation, der bevarer ligase-adenylate dannelse, men inaktiverer downstream-trin strand deltage reaktion har ingen indvirkning på bindingen til hakker DNA., Sekvestrering af et ekstrahelisk nukleotid ved DNA-bundet ligase minder om” base-flipping ” – mekanismen for målstedgenkendelse og katalyse, der anvendes af andre DNA-modifikation og reparationsen .ymer.

selvom 5′-fosfat-delen er essentiel for bindingen af Chlorella-viruligase til nicked DNA, er 3′ – OH-delen ikke nødvendig for nick-genkendelse. Chlorella virus ligase binder til en hakket ligand indeholdende 2′, 3 ‘dideo .y og 5′-phosphattermini, men kan ikke katalysere adenylering af 5’-enden., Således er 3 ‘ – OH vigtig for trin 2-Kemi, selvom den ikke selv er kemisk transformeret under DNA-adenylatdannelse.

for at afgrænse ligase-DNA-grænsefladen stillede vi ligasebindingsstedet på DNA. Størrelsen af e .onuclease III-fodaftrykket af ligase bundet til et enkelt nick i duple.DNA er 19 til 21 nukleotider. Fodaftrykket er asymmetrisk, der strækker sig 8 til 9 nukleotider på 3 ‘- OH-siden af nick og 11 til 12 nukleotider på 5’-phosphatsiden.,

krystalstruktur af Eukaryote DNA-Ligase-Adenylate

Chlorella virus-DNA ligase (ChVLig) er den mindste eukaryote ATP-afhængige ligase kendt. Som den” minimale ” DNA-ligase præsenterede den et attraktivt mål for strukturbestemmelse. Vi krystalliserede ChVLig og bestemte dens struktur ved 2 Å opløsning. Enzymet består af et større N-terminal nucleotidyltransferase (NTase) domæne og et mindre C-terminal OB domæne med en kløft mellem dem. En FORSTÆRKERDEL blev kovalent knyttet til n.af Lys27 på det aktive sted., Således har vi strukturen af et ægte katalytisk mellemprodukt.

Inden for de NTase domæne er en adenylate bindende lomme, der består af seks peptid motiver (i, Ia, III, III A, IV og V), der definerer den kovalente nucleotidyltransferase enzym overfamilie, der indeholder DNA-og RNA-ligaser og mRNA loft enzymer. Motiv I (K .dg .r) indeholder den lysin, som AMP bliver kovalent forbundet i det første trin af ligasereaktionen. Aminosyrer i Motiver Ia, III, IIIa, IV og V kontakter AMP og spiller væsentlige roller i et eller flere trin i ligationsvejen., OB-domænet består af en femstrenget antiparallel beta-tønde plus en alfa-Heli..

Strukturelle Grundlag for Nick Anerkendelse af en Minimal “Pluripotente” DNA-ligase

Selv om ChVLig mangler det store N – eller C-terminal tilknyttede domæner findes i eukaryote cellulære DNA, ligaser, at det kan opretholde mitotiske vækst, DNA-reparation, og nonhomologous end at deltage i spirende gær, da det er den eneste kilde til ligase i cellen. ChVLig kan endda udføre de væsentlige funktioner i pattedyrlig3 i mitokondrielt DNA-metabolisme., Vi foreslog, at ChVLig repræsenterer en skrabet-down “pluripotente” ligase, på grund af dens iboende nick sensing funktion, det grundlag, som blev belyst, når vi har løst 2.3 Å krystal struktur ChVLig-AMP bundet til en 3′-OH/5′-PO4 nick i duplex DNA.chvlig omkranser DNA ‘ et som en C-formet proteinklemme. Ntase-domænet binder til de ødelagte og intakte DNA-strenge i den store rille, der flankerer nick og også i den mindre rille på 3’-OH-siden af nick. OB-domænet binder sig over den mindre rille på forsiden af duple .et bag nick., En roman “latch” modul, der består af en beta-hairpin loop, der stammer fra OB domæne – indtager den store groove og fuldender omkreds klemme via kontakter mellem spidsen af løkken og overfladen af NTase domæne. Låsen er kritisk for Klemme Lukning og er en vigtig determinant for nick sensing.

sammenligning af krystalstrukturer af den frie og nick-bundet ChVLig-AMP afslører et stort domæne omlejringer ledsager nick anerkendelse., I den frie ChVLig-AMP reflekteres ob-domænet væk fra ntase-domænet for fuldt ud at udsætte den DNA-bindende overflade over AMP-bindende lomme. Peptidsegmentet, der er bestemt til at blive låsen, er forstyrret i den frie ligase og følsom over for proteolyse. Men dette segment er beskyttet mod proteolyse, når ChVLig binder til nicked DNA. DNA-binding indebærer en næsten 180 rotation af Ob-domænet omkring en drejning, så den konkave overflade af Ob beta-tønden passer ind i DNA-mindre rille., Denne overgang fremkalder en 63 Å-bevægelse af Ob-domænet og placerer låsen dybt i DNA-hovedrillen.

Et netværk af interaktioner med 3′-OH og 5′-PO4 termini i det aktive site belyst DNA adenylylation mekanisme, og de kritiske roller AMP i nick-sensing og katalyse. Tilsætning af en divalent kation udløste nick-forsegling i crystallo, hvorved det fastslås, at nick-komplekset er et bona fide-mellemprodukt i DNA-reparationsvejen.,

Struktur af NAD+-afhængig DNA-Ligase bundet til Hakker DNA-adenylate

NAD+-afhængig DNA ligaser (benævnt LigA) er en karakteristisk og strukturelt homogen undergruppe af enzymer findes i alle bakterier. E. coli LigA (671-aa) er prototypen af denne familie. LigA har en modulær arkitektur bygget op omkring en central ligasekerne sammensat af et ntase-domæne og et ob-domæne. Kernen er flankeret af en N-terminal “Ia” domæne og tre C-terminal moduler: et tetracysteine zink-finger, en helix-hårnål-helix (HhH) domæne, og en BRCT domæne., Hvert trin i ligationsvejen afhænger af en anden delmængde af LigA-domænerne, hvor kun ntase-domænet kræves for alle trin. Domæne Ia, der er unikke for NAD+-afhængige ligaser, er ansvarlig for bindende NMN-delen af NAD+, og er nødvendig for reaktionen med NAD+ til at danne ligase-AMP mellemliggende.

Vi fandt, at den nad+-afhængige E. coli DNA-ligase kan understøtte væksten af Saccharomyces cerevisiae-stammer, der slettes enkeltvis for CDC9 eller dobbelt for CDC9 plus LIG4., Dette er den første demonstration af, at et NAD+-afhængigt en .ym er biologisk aktivt i en eukaryot organisme. Efterfølgende undersøgelser (i samarbejde med Maria Jasin) viste, at E. coli LigA kunne være tilstrækkelig til ligasefunktion i mus ES-celler, der mangler det essentielle Lig3-en .ym.

vores krystalstruktur af E. coli LigA bundet til det hakkede DNA-adenylat-mellemprodukt afslørede, at LigA også omkranser DNA-Heli .en som en C-formet proteinklemme. Protein-DNA-grænsefladen indebærer omfattende DNA-kontakter af ntase -, OB-og HhH-domænerne over et 19-BP-segment af duple. – DNA centreret om nick., NTase-domænet binder til de ødelagte DNA-strenge ved og flankerer nick, ob-domænet kontakter den kontinuerlige skabelonstreng, der omgiver nick, og HHH-domænet binder begge tråde over den mindre rille ved periferien af fodaftrykket. Modulen-finger-modulet spiller en strukturel rolle i at bygge bro over Ob-og HHH-domænerne. Domæne Ia skaber ingen kontakter til DNA-duple .et, hvilket er i overensstemmelse med dets dispenserbarhed til katalyse af strenglukning på et AppDNA-substrat.,

Den LigA NTase og OB domæner er placeret på samme måde på DNA omkreds til NTase og OB domæner af ATP-afhængige DNA ligaser, og de “fodaftryk” lignende segmenter af DNA-strenge. Men topologien af LigA klemmen er stærkt forskellig fra klemmerne dannet af ChVLig og humant DNA ligase 1 (HuLig1, bestemt af Tom Ellenberger og kolleger). De kyssekontakter, der lukker LigA-klemmen, er sui generis, der involverer NTase-domænet og C-terminal HHH-domænet., Baseret på tilgængelige strukturelle data er det klart, at DNA-ligaser har udviklet mindst tre forskellige midler til at omslutte DNA.

Sammenligninger af E. coli-LigA—AppDNA komplekse strukturer på andre bakterielle ligaser fanget som den binære LigA•—NAD+ komplekse (trin 1 substrat), binær-LigA•—NMN komplekse (efter trin 1, der forlader gruppen), og kovalente ligase-AMP mellemliggende (trin 1 produkt efter at have forladt gruppen dissociation) fremhæve massive protein domæne-rearrangementer (størrelsesordenen 50 til 90 Å), der opstår i takt med substrat-bindende og katalyse., DNA-binding og klemmedannelse ved LigA indebærer en næsten 180 rotation af OB-domænet, således at den konkave overflade af Ob-beta-tønden passer ind i den mindre rille, svarende til det, der ses eller udledes for ChVLig og HuLig1. Den fire-punkts binding af HHH-domænet ved periferien af LigA-DNA-fodaftrykket stabiliserer en DNA-bøjning centreret ved nick. LigA-DNA-interaktionerne, der straks flankerer nick, inducerer en lokal DNA-forvrængning, hvilket resulterer i vedtagelse af en RNA-lignende a-form Heli., igen ekko resultaterne for HuLig1-DNA-kokrystallen.,

Mekanisme af lysin adenylylation af ATP-afhængige og NAD+-afhængige polynucleotide ligaser

auto-adenylylation reaktion polynucleotide ligaser er udført af en nucleotidyltransferase (NTase) domæne, der er bevaret i ATP-afhængige DNA og RNA ligaser og NAD+-afhængig DNA ligaser. Ntase-domænet inkluderer definerende peptidmotiver, der danner den nukleotidbindende lomme. Motiv I (K .dg) indeholder lysin, der bliver kovalent fastgjort til forstærkeren. Som Robert Lehman påpegede i 1974, er det uklart, hvordan lysin (med en forudsagt PKA-værdi på ~10.,5) mister sin proton ved fysiologisk pH for at opnå den ubeskyttede tilstand, der kræves til angreb på α-fosforet i ATP eller NAD+. I princippet kan ligase anvende en generel base til at deprotonere lysinen. Alternativt kan pKa blive drevet ned af positivt ladningspotentiale af proteinaminosyrer, der omgiver lysin-n.. Flere krystalstrukturer af ligaser fraværende metaller gav ringe støtte til begge forklaringer. I disse strukturer er motivet i lysin nucleophile placeret ved siden af et motiv IV glutamat eller aspartat sidekæde., Lysinen og motivet IV-Carbo .ylat danner et ionpar, hvis forventede virkning er at forøge PKA af lysin i kraft af omgivende negativ ladning. Det er usandsynligt, at en glutamat eller aspartatanion kunne tjene som generel base for at abstrahere en proton fra lysinkationen. En potentiel løsning på problemet ville være, hvis en divalent kation støder op til lysin-n.og kører ned sin PKA.,

En metal-drevet mekanisme blev afsløret af vores seneste krystal struktur Naegleria gruberi RNA-ligase (NgrRnl) som et skridt 1 Michaelis kompleks med ATP og mangan (sin foretrukne metal cofaktor). Nøglen til at fange Michaelis-lignende kompleks var udskiftningen af lysin-nukleofilen med et isosterisk methionin. Strukturen på 1,9 Å indeholdt ATP og to manganioner på det aktive sted. Det” katalytiske ” metal blev koordineret med oktaedral geometri til fem farvande, der igen blev koordineret af Carbo .ylatsidekæderne af konserverede rester i motiver I, III og IV., Det sjette ligandsted i det katalytiske metalkompleks blev besat af et ATP a-phosphato oxygenygen, hvilket indikerede en rolle for metallet til stabilisering af overgangstilstanden for auto-adenylyleringsreaktionen. En vigtig indsigt, befæstet ved superposition af Michaelis komplekse struktur af kovalente NgrRnl-(Lys-Nz)–AMP mellemliggende, drejede sig om den rolle af den katalytiske metal komplekse i at stabilisere fn-protoniserede tilstand af lysin nucleophile forud for katalyse, via lokale positiv ladning og atomic kontakt af Lys-Nz til en af metal-bundet vand., Den NgrRnl Michaelis komplekse afsløret et andet metal, koordineret octahedrally til fire farvande, og at ATP-β og γ fosfat oxygens. Metalkomplekset og ATP γ-phosphatet blev forlovet af et ensemble af aminosyresidekæder (unikt for NgrRnl), der kollektivt orienterer PPi, der forlader gruppen apikal til lysin-nukleofilen. I overensstemmelse med en enkelt-trins in–line mekanisme blev phosphate-phosphatet stereokemisk inverteret under overgangen fra Ngrrnl•ATP Michaelis comple.til lysyl-AMP intermediate.,

DNA ligaser menes at have udviklet sig adskilt fra RNA ligaser, i første omgang ved fusion af en slægts-ATP-udnytte NTase domæne til en C-terminal OB domæne (at omfatte den minimale katalytisk kernen af en DNA-ligase), og efterfølgende via fusion af yderligere strukturelle moduler til NTase-OB core (7). NAD+ – afhængige DNA-ligaser (LigA-en .ymer), som er allestedsnærværende i bakterier og essentielle for bakteriel levedygtighed, erhvervede deres specificitet for NAD+ via fusion af et Nmn-bindende Ia-domænemodul til N-terminalen i NTase-domænet., Escherichia coli DNA-ligase (EcoLigA) var den første cellulære DNA-ligase opdaget og karakteriseret, og det er fortsat den førende model for strukturelle og funktionelle studier af NAD+-afhængig DNA-ligase familie. Interessen for LigA-mekanismen drives af løftet om at målrette LigA (via dens signatur nad+ substratspecificitet og unikke strukturelle træk over for humane DNA-ligaser) til antibakteriel lægemiddelopdagelse.

vi løste en 1.55 Å krystalstruktur af EcoLigA som et Michaelis kompleks med NAD+ og magnesium., Den struktur, der afslører en one-metal mekanisme, hvor en ligase-bundet Mg2+(H2O)5 komplekse sænker lysin, pKa og engagerer NAD+ α fosfat, men β-fosfat og nicotinamid nukleosid af NMN forlader gruppen er orienteret, udelukkende via atomic interaktioner med protein elementer, der er unikke for den LigA clade. Den to-metal (for ATP-afhængig ligase) versus en-metal (for NAD+ – afhængig ligase) dikotomi afgrænser et grenpunkt i ligase evolution.