genetické spojení mezi DNA a cesty opravy a lidské predispozice rakoviny podnítily zájem o bílkoviny, které rozpoznávají a opravy specifických místech DNA poškození. Opravy enzymy jsou pozoruhodně zachovány z bakterií, hub pro člověka, což podtrhuje prémiové kladen na zachování genomové integrity tváří v tvář mutagenní zátěž., DNA je náchylná k poškození způsobenému chybami spáchanými během replikace a faktory prostředí, jako je záření, oxidanty nebo alkylační činidla. Opravné reakce zahrnují excizi chemicky změněných nebo mispaired bází z duplexu DNA. Výsledné mezery jsou vyplněny DNA polymerázami; tato reakce zanechává nick nebo lemující místo opravy. Obdobný proces se vyskytuje během chromozomální DNA replikace, přičemž 5′-RNA segmentů, které prime diskontinuální syntéza Okazaki fragmenty jsou vyříznuty a intervenující mezery jsou vyplněny pomocí DNA polymerázy.,

oprava DNA a replikace cesty se sbíhají na společném posledním krokem, ve kterém kontinuitu opravit DNA je obnovena pomocí DNA ligázy, enzymu, který převádí zářezy do phosphodiester dluhopisů. Nicks jsou potenciálně škodlivé léze DNA, které, pokud nejsou opraveny, mohou způsobit smrtelné přestávky s dvojitým vláknem. Celková ztráta funkce DNA ligázy je tedy smrtelná.

DNA Ligázy Reakce

DNA ligázy katalyzují spojení 5′-fosfát-ukončen pramen na 3′-hydroxyl-ukončen pramen., Ligace závisí na hořčíku a vysokoenergetickém kofaktoru, buď ATP nebo NAD+. Reakční mechanismus zahrnuje 3 sekvenční nukleotidylové přenosové reakce. V prvním kroku, nucleophilic útok na alfa-fosforu z ATP (adenosin trifosfát) nebo NAD+ (nikotinamidadenindinukleotid) ligázy následek uvolnění pyrofosforečnan nebo NMN (nikotinamid mononucleotide) a vytvoření kovalentní meziprodukt (ligase-adenylát), ve kterém AMP je spojen prostřednictvím phosphoamide (P-N) vazba na epsilon-amino skupinou lysinu., V druhém kroku, AMP je převedena na 5′-konci 5′-fosfát-ukončen DNA vlákno tvoří DNA-adenylát — inverzní pyrofosforečnan mostní konstrukce, AppN. V této reakci, 5′-fosfát, kyslík DNA útoky fosforu z ligase-adenylát; aktivní místě lysin postranní řetězec je opuštění skupiny. Ve třetím kroku, ligáza katalyzuje útok 3 ‚ – OH nick na DNA-adenylátu připojit 2 polynukleotidy a osvobodit AMP.

fylogenetická distribuce

živé organismy zahrnují 3 domény: eubacteria, archaeabacteria a eukaryoty., Všechny organismy kódují 1 nebo více ligáz DNA. Na ligázy jsou seskupeny do 2 rodiny, ATP-závislé ligázy a NAD+-závislé ligázy, podle nukleotidové substrátu potřebné pro ligase-adenylát formace. Dna ligázy závislé na ATP se nacházejí ve všech 3 doménách. NAD + – dependentní DNA ligázy (LigA) jsou všudypřítomné v bakteriích, kde jsou nezbytné pro růst a představují atraktivní cíle pro antiinfekční objev léků. Nad + – dependentní ligázy se vyskytují pouze sporadicky mimo bakteriální doménu života, např.,, v Halofilní archaea a některých dna virech a byly pravděpodobně získány v těchto taxonech horizontálním přenosem genů.

eukaryotické buněčné ligázy závislé na ATP

dna ligázy závislé na ATP se vyskytují u všech eukaryotických druhů. Savčí buňky obsahují čtyři isozymy dna ligázy. Aminokyseliny-sekvence srovnání naznačují, že jádro katalytické domény společné pro všechny ATP-dependentní ligázy je ozdoben další izoenzymové-konkrétní domény nachází na aminokyseliny nebo karboxylové termini proteinů., Předpokládá se, že tyto doprovodné segmenty zprostředkovávají vazbu ligáz DNA savců na jiné proteiny zapojené do replikace DNA, opravy a rekombinace. Savců izoenzymy jsou označovány jako ligázy jsem, ligázy IIIa, ligázy iii B, a ligázy IV. DNA ligázy jsem je 919-aminokyselinový polypeptid, vyjádřená ve všech tkáních, který katalyzuje spojování Okazaki fragmenty DNA během replikace a také hraje roli v opravě DNA., DNA ligázy IIIa (922 aminokyselin) a IIIb (862 aminokyseliny) jsou produkty jednoho genu; oni se liší v sekvenci aminokyselin pouze na jejich karboxylové termini jako důsledek alternativních mRNA sestřih. Ligáza IIIa je vyjádřena všudypřítomně a je zapojena do opravy DNA a je nezbytná pro mitochondriální funkci. Exprese ligázy IIIb je omezena na varlata, konkrétně na spermatocyty podstupující meiózu. DNA ligázy IV je 911-aminokyselinový polypeptid, který hraje roli v opravě double-strand DNA přestávky přes non-homologní end joining (NHEJ).,

Kvasinkové buňky obsahují 2 samostatně kódovány DNA ligázy, které jsou homologní k savčí DNA ligázy i a IV, resp. DNA ligáza i (Cdc9p) začínajících kvasinek Saccharomyces cerevisiae je nezbytná pro růst buněk. Genetické experimenty implikují ligázu i při utěsnění fragmentů Okazaki a při dokončení opravy excize DNA. Naproti tomu kvasinková dna ligáza IV není nezbytná pro růst buněk. Nicméně, odstranění LIG4 genu vyvolává fenotypy, což naznačuje, že ligázy IV katalyzuje opravu dvojitých zlomů v non-homologní end vstupu dráhy (NHEJ)., Pučící kvasinky nemají žádný zjevný homolog savčí DNA ligázy III.

Virové ATP-Dependentní DNA Ligázy

Bakteriální DNA viry, jako je E. coli bakteriofágů T4, T6, T7, T3, kódování své vlastní ATP-dependentní DNA ligázy. Dna ligázy závislé na ATP jsou také kódovány eukaryotickými DNA viry, které provádějí určitý nebo celý jejich replikační cyklus v cytoplazmě. Patří mezi ně virus vaccinia, virus afrického moru prasat a virus Chlorella PBCV1. Bakteriofág a eukaryotické virové DNA ligázy jsou menší než jejich buněčné protějšky., Vakcínie DNA ligázy, 552 aminokyselin v polypeptidu, je nápadně podobný na aminokyseliny-sekvence úrovni savčí DNA ligázy III. Opravdu, ligázy III je více úzce souvisí s vakcínie ligase, než savců ligázy i a IV. Na T4 ligázy (487 aminokyselin), T7 (359 aminokyselin), T3 (346 aminokyselin), a Chlorella virus (298 aminokyseliny) jsou ještě menší. Ukázali jsme, že ligáza viru Chlorella může doplnit růst kvasinkového kmene, ve kterém byl gen DNA ligázy i odstraněn., Tento výsledek naznačuje, že proteinové segmenty jedinečné pro mnohem větší dna ligázu i nejsou nezbytné pro růst kvasinkových buněk.

Nick-Sensing pomocí DNA ligáz

zkoumali jsme interakci eukaryotických ligáz s DNA pomocí virů kódovaných enzymů jako modelů. Virus vakcínie DNA ligázy a Chlorella virus DNA ligázy každý tvoří samostatný komplex s jednotlivě škrábla DNA ligandu v nepřítomnosti hořčíku, který může být vyřešen od volné DNA pomocí nativní polyakrylamidové gelové elektroforézy., Virové ligázy netvoří stabilní komplexy s následující ligandy: (i) DNA obsahující 1 nukleotidu, nebo 2-nukleotidů mezera; (ii) uzavřené duplex DNA produktu ligační reakce; (iii) jednotlivě škrábla duplex obsahující 5′-OH konec v nicku místo 5′-fosfát; nebo (iv) jednotlivě škrábla duplex obsahující RNA na 5′-fosfát straně nick (10 až 15). Virové ATP-dependentní DNA ligázy tak mají vnitřní funkci snímání.,

Nick uznání vakcínie DNA ligázy a Chlorella virus DNA ligázy také závisí na obsazenosti AMP závazné kapsa na enzym — tj. mutace ligázy aktivní stránky, které zrušily schopnost tvořit ligase-adenylát intermediate také eliminovat nick uznání; vzhledem k tomu, že mutace, která zachovává ligase-adenylát formace, ale inaktivuje navazujících kroků vlákna spojující reakce nemá vliv na vazbu na vruby DNA., Sekvestrace z extrahelical nukleotidů v DNA vazbou ligázy je připomínající „base-překlopení“ mechanismus cílového místa uznání a katalýzy používán jinými DNA, modifikace a opravy enzymy.

přestože je 5 ‚- fosfátová skupina nezbytná pro vazbu ligázy viru chlorelly na sekanou DNA, 3 ‚ – OH se nevyžaduje pro rozpoznávání Nicka. Ligáza viru chlorelly se váže na vroubkovaný ligand obsahující 2′, 3′ dideoxy a 5′-fosfátové termini, ale nemůže katalyzovat adenylaci 5′-konce., 3‘-OH je tedy důležitý pro chemii kroku 2, i když není sám chemicky transformován během tvorby DNA-adenylátu.

pro vymezení rozhraní ligáza-DNA jsme footprinted vazebného místa ligázy na DNA. Velikost stopy ligázy exonukleázy III vázané na jediný nick v duplexní DNA je 19 až 21 nukleotidů. Stopa je asymetrická, rozšiřuje 8 až 9 nukleotidů na straně 3 ‚- OH nick a 11 až 12 nukleotidů na straně 5‘-fosfátu.,

krystalová Struktura Eukaryotické DNA Ligase-Adenylát

Chlorella virus DNA ligázy (ChVLig) je nejmenší eukaryotické ATP-dependentní ligázy známé. Jako“ minimální “ dna ligáza představovala atraktivní cíl pro stanovení struktury. Krystalizovali jsme ChVLig a určili jeho strukturu na 2 Å rozlišení. Enzym se skládá z větší N-terminální nukleotidyltransferázy (ntase) domény a menší C-terminální OB domény s rozštěpem mezi nimi. AMP moiety byl kovalentně spojen s NZ Lys27 na aktivním místě., Máme tedy strukturu skutečného katalytického meziproduktu.

V NTase domény je adenylát závazné kapsy složený ze šesti peptidové motivy (I, Ia, III, IIIa, IV a V), které definují kovalentní nucleotidyltransferase enzymu, nadčeleď, který obsahuje DNA a RNA ligázy a mRNA omezení enzymy. Motif I (KxDGxR) obsahuje lysin, ke kterému se AMP stává kovalentně spojen v prvním kroku ligázové reakce. Aminokyseliny v motivech Ia, III, IIIa, IV a v kontaktní AMP a hrají zásadní roli v jednom nebo více krocích ligační dráhy., Ob doména se skládá z pětivláknové antiparalelní beta barel plus alfa helix.

Strukturální Základ pro Nick Uznání Minimální „Pluripotentní“ DNA ligázy

i když ChVLig chybí velké N – nebo C-koncové doprovodná domén nalezené v eukaryotické buněčné DNA ligázy, to může udržet mitotické růst, opravy DNA, a nehomologní end spojení v pučící kvasinky, když je to jediný zdroj ligase v buňce. ChVLig může dokonce provádět základní funkce savčího Lig3 v metabolismu mitochondriální DNA., Navrhli jsme, že ChVLig představuje svlékl-dole „pluripotentní“ ligase vzhledem k jeho vnitřní nick snímání funkce, na základě kterých byla osvětlena, když jsme vyřešili 2.3 Å krystalové struktury ChVLig-AMP vázán na 3′-OH/5′-PO4 nick v duplex DNA.

ChVLig obklopuje DNA jako proteinovou svorku ve tvaru C. Doména NTase se váže na zlomené a neporušené řetězce DNA v hlavní drážce lemující nick a také v menší drážce na straně 3 ‚ – OH nick. Ob doména se váže přes menší drážku na obličeji duplexu za Nickem., Román „zámek“ modul – skládá se z beta-vlásenka smyčka, která vychází z OB domény – zaujímá hlavní drážky a doplňuje obvodový svorky prostřednictvím kontaktů mezi špičkou smyčce a povrch NTase domény. Západka je rozhodující pro uzavření svorky a je klíčovým determinantem nick sensing.

srovnání krystalových struktur volného a Nickem vázaného ChVLig-AMP odhaluje velké přeskupení domén doprovázející rozpoznávání nicků., Ve volném ChVLig-AMP se ob doména odráží od domény NTase, aby plně odhalila povrch vázající DNA Nad kapsou vázající amp. Peptidový segment, který je určen k tomu, aby se stal západkou, je neuspořádaný ve volné ligáze a citlivý na proteolýzu. Tento segment je však chráněn před proteolýzou, když se ChVLig váže na ukradenou DNA. Vazba DNA znamená téměř 180 Otáčení ob domény kolem otočného, takže konkávní povrch OB beta hlavně zapadá do dna menší drážky., Tento přechod vyvolává 63 Å pohyb OB domény a umístí západku hluboko do DNA hlavní drážky.

síť interakcí s 3’OH a 5′-PO4 termini v aktivním místě osvětlené DNA adenylylation mechanismus a kritické role AMP v nicku-snímání a katalýzy. Přidání dvojmocných kationtů spustil nick těsnění v crystallo, a tak stanoví, že nick komplex je bona fide meziprodukt v DNA opravné dráhy.,

Struktura NAD+-dependentní DNA Ligázy povinen Škrábla DNA-adenylát

NAD+-dependentní DNA ligázy (dále jen LigA) jsou výrazné a strukturálně homogenní clade enzymů, které se nacházejí ve všech bakterií. E. Coli LigA (671-aa) je prototypem této rodiny. LigA má modulární architekturu postavenou kolem centrálního ligázového jádra složeného z domény NTase a domény OB. Jádro je lemováno N-terminální „Ia“ domény a tři C-terminální moduly: tetracysteine zinek prst, helix-hairpin-helix (HhH) domény, a BRCT domény., Každý krok ligační dráhy závisí na jiné podmnožině domén ligy, přičemž pro všechny kroky je vyžadována pouze doména NTase. Doména Ia je jedinečná pro NAD+-dependentní ligázy, je zodpovědná za vazbu NMN moiety NAD + a je nutná pro reakci s NAD+ k vytvoření meziproduktu ligázy-AMP.

zjistili jsme, že NAD+závislá dna ligáza E.coli může podporovat růst kmenů Saccharomyces cerevisiae smazaných jednotlivě pro cdc9 nebo dvojnásobně pro CDC9 Plus LIG4., Toto je první ukázka toho, že enzym závislý na NAD+je biologicky aktivní v eukaryotickém organismu. Následné studie (ve spolupráci s Marií Jasinovou) ukázaly, že E.Coli LigA by mohla stačit pro funkci ligázy v myších ES buňkách postrádajících základní enzym Lig3.

Naše krystalové struktury z E. coli LigA vázán na vruby DNA-adenylát střední ukázal, že LigA se také obklopuje šroubovice DNA jako C-tvaru bílkovin svorky. Rozhraní protein-DNA zahrnuje rozsáhlé kontakty DNA doménami NTase, OB a HhH přes segment duplexní DNA 19 bp zaměřený na nick., Na NTase doména se váže na rozbité DNA a doprovodných nick, OB domény kontakty kontinuální šablony pramen kolem nicku, a HhH domény váže oba prameny přes drobné drážky na obvodu stopy. Modul Zn-finger hraje strukturální roli při přemostění domén OB a HhH. Doména Ia nečiní žádné kontakty na duplex DNA, v souladu s jeho dispenzovatelností pro katalýzu uzavření pramene na substrátu AppDNA.,

LigA NTase a OB domény jsou umístěny podobně jako na DNA obvod NTase a OB domén ATP-dependentní DNA ligázy, a „stopy“ podobné segmenty DNA. Topologie svorky LigA je však ostře odlišná od svorek vytvořených Chvligem a lidskou DNA ligázou 1 (HuLig1, určenou Tomem Ellenbergerem a kolegy). Líbací kontakty, které uzavírají svorku ligy, jsou sui generis, zahrnující doménu NTase a doménu HHH C-terminal., Na základě dostupných strukturálních údajů je zřejmé, že DNA ligázy vyvinuly alespoň tři různé prostředky obklíčení DNA.

Srovnání E. coli LigA—AppDNA komplex s konstrukcí z jiné bakteriální ligázy zachytil jako binární LigA•—NAD+ komplexní (krok 1 substrátu), binární LigA•—NMN komplex (post-krok 1 opuštěním skupiny), kovalentní ligase-AMP meziproduktu (krok 1 produkt poté, co opustil skupinu disociace) zvýrazněte masivní proteinové domény přestavby (v pořadí od 50 do 90 Å), které se vyskytují v synchronizaci s substrát-vazebné a katalýzy., Vazba na DNA a svorky formace LigA zahrnuje téměř 180 otáčení OB domény tak, že konkávní povrch OB beta barel se hodí do menší drážky, podobné tomu, co je pozorováno nebo vyvozeno pro ChVLig a HuLig1. Čtyřbodová vazba HHH domény na okraji stopy LigA-DNA stabilizuje ohyb DNA soustředěný na nick. Interakce LigA-DNA okamžitě lemující nick indukují lokální zkreslení DNA, což má za následek přijetí spirály RNA-like a-form, opět odrážející nálezy kokrystalu HuLig1-DNA.,

Mechanismus lysin adenylylation tím, ATP-závislá a NAD+-závislé polynucleotide ligázy

auto-adenylylation reakce polynucleotide ligázy se provádí nucleotidyltransferase (NTase) doménu, která je zachována v ATP-dependentní DNA a RNA ligázy a NAD+-dependentní DNA ligázy. Doména ntase zahrnuje definování peptidových motivů, které tvoří kapsu vázající nukleotid. Motif I (KxDG) obsahuje lysin, který se kovalentně připojuje k zesilovači. Jak Robert Lehman poukázal v roce 1974, není jasné, jak lysin (s předpokládanou hodnotou pKa ~10.,5) ztrácí svůj proton při fyziologickém pH, aby dosáhl nechráněného stavu potřebného pro útok na α fosfor ATP nebo NAD+. V zásadě může ligáza použít obecnou základnu pro deprotonaci lysinu. Alternativně by pKa mohla být poháněna pozitivním nábojovým potenciálem proteinových aminokyselin obklopujících lysin-Nz. Několik krystalických struktur ligáz nepřítomných kovů poskytlo nedostatečnou podporu pro vysvětlení. V těchto strukturách je motif i lysin nucleophile umístěn vedle motivu IV glutamátu nebo aspartátového postranního řetězce., Lysin a motiv IV karboxylát tvoří iontový pár, jehož předpokládaným účinkem je zvýšení pKa lysinu na základě okolního negativního náboje. Je nepravděpodobné, že by glutamát nebo aspartátový anion mohl sloužit jako obecná báze k abstrakci protonu z kationtu lysinu. Potenciálním řešením problému by bylo, kdyby dvojmocný kation dosedl na lysin-Nz a pohání jeho pKa.,

mechanismus řízený kovem byl odhalen naší nedávnou krystalickou strukturou ligázy Naegleria gruberi RNA (NgrRnl) jako komplexu Michaelis s ATP a manganem (jeho preferovaný kovový kofaktor). Klíčem k zachycení Michaelis-jako složité bylo nahrazení lysin nukleofil tím, isosteric methionin. Struktura 1.9 Å obsahovala ATP a dva manganové ionty v aktivním místě. „Katalytické“ metal byla koordinována s osmibokou geometrie na pět vod, které jim byly následně koordinovány karboxylát postranních řetězců zachovány zbytky v motivech I, III, a IV., Šesté místo ligandu v katalytickém kovovém komplexu bylo obsazeno kyslíkem ATP α fosfátu, což svědčí o roli kovu při stabilizaci přechodového stavu autoadenylační reakce. Klíčový vhled, opevněné superpozice Michaelis komplex na strukturu kovalentní NgrRnl-(Lys-Nz)–AMP intermediate, se týkal role katalytický komplex kovu při stabilizaci osn-protonované stavu lysin nukleofil před katalýzy, přes místní kladný náboj a atomové kontakt Lys-Nz na jednu z kovu vázané vody., Komplex Ngrnl Michaelis odhalil druhý kov, koordinovaný oktahedrally na čtyři vody a na ATP β a γ fosfátové oxygeny. Kovové komplexní a ATP, γ-fosfátu byli zapojeni do kompletu amino kyselina postranní řetězce (unikátní NgrRnl), které společně orient PPi opuštění skupiny apikální na lysin nukleofil. V souladu s single-step in-line mechanismus, α fosfát byl stereochemically převrácený při přechodu z NgrRnl•ATP Michaelis složité lysyl–AMP intermediate.,

DNA ligázy jsou myšlenka k se vyvinuli odděleně od RNA ligázy, zpočátku při splynutí rodové ATP-využití NTase domény na C-terminální OB domény (zahrnuje minimální katalytického jádra DNA ligázy), a následně pomocí syntézy dalších konstrukčních modulů k NTase-OB jádra (7). NAD+-dependentní DNA ligázy (LigA enzymy), které jsou všudypřítomné bakterie a jsou zásadní pro životaschopnost bakteriálních, získal jejich specifičnost pro NAD+ přes fusion z NMN-vazba Ia domény, modul pro N-konci NTase domény., Escherichia coli DNA ligázy (EcoLigA) byl první buněčné DNA ligázy objeven a charakterizován a zůstává premiér model pro strukturní a funkční studie z NAD+-dependentní DNA ligázy rodiny. Zájem LigA mechanismus je poháněn příslib cílení LigA (přes jeho podpis NAD+ substrátová specificita a jedinečné konstrukční vlastnosti vůči lidské DNA ligázy) pro anti-bakteriální drog objev.

řešili jsme 1,55 Å krystalovou strukturu Ecoligy jako komplex Michaelis s NAD+ a hořčíkem., Struktura odhaluje jeden-kovový mechanismus, ve kterém ligase-vázán Mg2+(H2O)5 komplex snižuje lysin pKa a zapojuje NAD+ α fosfát, ale β fosfát a nikotinamid nukleosidů z NMN opuštění skupiny jsou orientované výhradně prostřednictvím atomové interakce s proteinem prvky, které jsou jedinečné pro LigA clade. Dvou-kov (pro ATP-dependentní ligázy) versus jedno-kovové (pro NAD+-závislé ligázy) dichotomie vymezuje bod zlomu v ligázy evoluce.