monoaminooxidázy test detekuje přítomnost cytochrom oxidáza systém, který bude katalyzovat přenos elektronů mezi dárci elektronu v bakterie a redoxní barvivo – tetramethyl-p-fenylendiaminu. Barvivo je redukováno na tmavě fialovou barvu., Tento test se používá k pomoci při identifikaci Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella a Pasteurella, které produkují enzym cytochrom oxidáza.

pro tento test lze použít řadu činidel.,

• Kovacs Oxidase Reagent:

1% tetra-methyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water

• Gordon and McLeod’s Reagent:

1% dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, in water

• Gaby and Hadley (indophenol oxidase) Reagent:

1% α-naphthol in 95% ethanol

1% p-aminodimethylaniline HCL

Principle of Oxidase Test

Cytochrome containing organisms produce an intracellular oxidase enzyme. This oxidase enzyme catalyzes the oxidation of cytochrome c., Organismy, které obsahují cytochromu c jako součást jejich dýchacího řetězce jsou oxidáza-pozitivní a otočte činidla modré/fialové. Organismy chybí cytochromu c jako součást jejich dýchací řetězec není oxidaci činidlem, přičemž je bezbarvý v rámci testu, a jsou oxidáza-negativní.

pozitivní bakterie oxidázy mají cytochrom oxidázu nebo indofenol oxidázu (železo obsahující hemoprotein). Oba tyto katalyzují transport elektronů z dárcovských sloučenin (NADH) na akceptory elektronů (obvykle kyslík)., Zkoušené činidlo, n, n, N‘, n‘-tetramethyl-p-fenylendiamin dihydrochlorid působí jako umělý akceptor elektronů pro enzym oxidázu. Oxidované činidlo tvoří barevnou sloučeninu indofenolově modré.

cytochromový systém je obvykle přítomen pouze v aerobních organismech, které jsou schopné využívat kyslík jako konečný vodíkový receptor. Konečným produktem tohoto metabolismu je buď voda nebo peroxid vodíku (rozložený katalázou).

účel / použití testu oxidázy

• test oxidázy se používá k určení, zda organismus má enzym cytochromoxidázy.,
• test se používá jako pomůcka pro odlišení Neisseria, Moraxella, Campylobacter a Pasteurella (oxidáza pozitivní).
• používá se také k odlišení pseudomonád od příbuzných druhů.

postup testu oxidázy

existuje mnoho variant metod pro test oxidázy. Patří sem, ale nejsou omezeny na, test filtračního papíru, metoda přímé desky, metoda tamponu, impregnovaná metoda oxidázového testovacího proužku a metoda zkumavky. Všechny časy a koncentrace jsou založeny na původních doporučeních.,

Suchý Filtrační Papír Metoda

Od monoaminooxidázy činidla je nestabilní a musí být čerstvě připravený pro použití této metody je výhodné.

1. proužek filtračního papíru č. 1 Whatman je namočen v čerstvě připraveném 1% roztoku tertramethyl-p-fenylendihydrochloridu.
2. po vypuštění po dobu asi 30 sekund jsou proužky lyofilizovány a uloženy v tmavé láhvi těsně uzavřené šroubovacím uzávěrem.
3. pro použití se odstraní pás, položí se do Petriho misky a navlhčí se destilovanou vodou.,
4. kolonie, která má být testována, je zachycena platinovou smyčkou a rozmazána přes vlhkou oblast.
5. pozitivní reakce je indikována intenzivní tmavě fialovou barvu a odstín, objevují během 5 až 10 sekund, „opožděné pozitivní“ reakce zabarvení v 10-60 sekund, a negativní reakce tím, že absence barvení nebo zbarvení později, než 60 sekund.

Vlhký Filtrační Papír Metoda

1. proužek filtračního papíru se namočí s trochou čerstvě připraveného 1% roztoku činidla.
2. na něj je nanesena skvrna kultury platinovou smyčkou.,
3. pozitivní reakce je indikována intenzivní tmavě fialovou barvu a odstín, objevují během 5 až 10 sekund, „opožděné pozitivní“ reakce zabarvení v 10-60 sekund, a negativní reakce tím, že absence barvení nebo zbarvení později, než 60 sekund.

metoda přímé desky

1. přidejte 2 -3 kapky činidla přímo k podezřelým koloniím na agarové desce. Nehromažďujte desku činidlem.
2. pozorujte změnu barvy během 10 sekund.

Poznámka: metoda přímé desky by měla být prováděna na neselektivní agarové desce.,

1. Při použití Kovac je monoaminooxidázy činidla, mikroorganismy jsou oxidáza pozitivní, když se barva změní na tmavě fialové během 5 až 10 sekund. Mikroorganismy jsou zpožděny oxidáza pozitivní, když se barva změní na fialovou během 60 až 90 sekund. Mikroorganismy jsou oxidázy negativní, pokud se barva nemění nebo trvá déle než 2 minuty.
2. při použití činidla Gordon a McLeod jsou mikroorganismy oxidázy pozitivní, když se barva změní na červenou během 10 až 30 minut nebo na černou během 60 minut. Mikroorganismy jsou oxidázy negativní, pokud se barva nezmění.,

Tampon Metoda

1. Ponořte tampon do činidla a poté se dotkněte izolované podezřelý kolonie
2. Pozorujte změny barvy během 10 sekund.

metoda zkumavky

1. pěstujte čerstvou kulturu (18 až 24 hodin) bakterií ve 4,5 ml živného vývaru (nebo standardních médií, která neobsahují vysokou koncentraci cukru).
2. Přidat 0,2 ml 1% α-naftol, pak přidat 0,3 ml 1% p-aminodimethylaniline oxalát (Gaby a Hadley činidla).
3. důkladně protřepejte, aby bylo zajištěno míchání a důkladné okysličení kultury.,
4. pozorujte změny barev.
5. mikroorganismy jsou oxidázy pozitivní, když se barva změní na modrou během 15 až 30 sekund. Mikroorganismy jsou zpožděny oxidáza pozitivní, když se barva změní na fialovou během 2 až 3 minut. Mikroorganismy jsou oxidázy negativní, pokud se barva nezmění.

interpretace výsledků testu oxidázy

pozitivní výsledek

vývoj tmavě purpurově modré / modré barvy indikuje produkci oxidázy během 5-10 sekund.

negativní výsledek

žádná Purpurově modrá barva / žádná změna barvy.,

Examples

Oxidase Positive Organisms: Pseudomonas, Neisseria, Alcaligens, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella, Pasteurella, Moraxella, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, etc.

Oxidase Negative Organisms: Enterobacteriaceae (e.g. E., coli)

Kontrola Kvality pro Oxidázový Test

Pozitivní Kontrola: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Negativní Kontrola: Escherichia coli ATCC 25922

Omezení Monoaminooxidázy Zkoušky

1. činidel používaných v monoaminooxidázy testu bylo prokázáno, že auto-oxidaci, tak to je velmi důležité používat čerstvé činidla, ne starší než 1 týden.
2. Oba bakterií a kvasinek pěstovaných na médiu s vysokou koncentrací glukózy show inhibována monoaminooxidázy činnost, takže se doporučuje, aby test kolonií pěstovaných na médiu bez přebytečného cukru, jako živného agaru., Tryptický sójový agar je také vynikajícím médiem.
3. bakterie pěstované na médiích obsahujících barviva mohou přinést aberantní výsledky.
4. testovací činidla účinně zabíjejí mikroorganismy, takže subkulturování by mělo být provedeno před přidáním jakéhokoli činidla do aktivní kultury.
5. test oxidázy lze použít při předpokládané identifikaci Neisserie a při diferenciaci a identifikaci gramnegativních bacilů. Oxidáza-pozitivní organismy, by měl být vyšetřen gramovo barvení k určení morfologie a gram reakce., Pro úplnou identifikaci se doporučují další biochemické testy.
6. použití nichromu nebo jiné smyčky obsahující železo může vyvolat falešně pozitivní reakce. Doporučujeme platinové smyčky.
7. většina Haemophilus je oxidázově pozitivní. Méně citlivé proužky nebo činidla mohou přinést falešně negativní výsledky.
8. Monoaminooxidázy reakce gram-negativní bacily by měla být stanovena na neselektivní a non-diferenciální média pro zajištění platných výsledků. Také kolonie odebrané z médií obsahujících vysoké hladiny glukózy mohou vyvolat falešně negativní reakce.,
9. doporučuje se používat kolonie staré 18-24 hodin. Starší kolonie budou mít slabší reakce.
10. jakékoli změny barvy, které se objeví po 20 sekundách, by neměly být brány v úvahu.