metody sekvenování nové generace (NGS) se začaly objevovat v literatuře v polovině roku 2000 a měly transformační účinek na naše chápání mikrobiální genomiky a infekčních onemocnění. Existuje však značná diskuse o tom, jak, kdy a kde bude sekvenování příští generace hrát roli v klinické diagnostické laboratoři., Hluboký ponor bod-kontrapunkt diskuse z Deníku Klinické Mikrobiologie popisuje výzvy a příležitosti, které mohou přijít s zavedení metagenomic příští generace sekvenování (mNGS) do rutinní laboratoře. Co přesně je mNGS a jak se liší od mnoha dalších technologií nukleových kyselin?

co je Metagenomické sekvenování nové generace?

sekvenování nové generace je některou z několika vysoce výkonných sekvenačních metod, přičemž miliardy fragmentů nukleové kyseliny mohou být současně a nezávisle sekvenovány., Kontrast této techniky s klasickými metodami, jako je sekvenování Sanger (také známý jako sekvenování ukončení dideoxynukleotidového řetězce), který zpracovává jednu nukleotidovou sekvenci na reakci.
charakterizovat bakteriální genom pomocí NGS, například genom je rozdělen do více fragmentů, které produkují sekvence nebo čte v rozmezí od stovek do desítek tisíc bází na délku. Sekvence jsou sestaveny do jednoho genomu pomocí výpočetních přístupů. Několik překrývající se sekvence čte se dal dohromady vyrábět jeden delší sekvence tzv. contig., Tam jsou často mezery mezi contigs a ačkoli high-fidelity delší sekvence čte by byl ideální způsob sekvenování, platformy, které produkují kratší čtení jsou obecně méně nákladné a překrytí v sekvencích je přesnější. Konstruovaný genom (pravděpodobně obsahující mezery) je zarovnán s referenční databází pro identifikaci organismu. Tato technologie představuje podstatný pokrok v prvních dnech sekvenování, kdy by jeden projekt bakteriálního genomu mohl trvat několik let.,
Metagenomic NGS (mNGS) je prostě běh všech nukleových kyselin ve vzorku, která může obsahovat smíšená populace mikroorganismů, a přiřazení těchto jejich referenční genomy pochopit, jaké mikroorganismy jsou přítomny a v jakém poměru. Schopnost pořadí a identifikovat nukleové kyseliny z více různých taxonů pro metagenomic analýzy je tento výkonný nová platforma, která může současně identifikovat genetický materiál z úplně jiného království organismů.,
možné klinické aplikace jsou obrovské, včetně diagnostiky infekčních onemocnění, sledování ohniska, sledování infekce a objevení mutací a patogenů. mNGS, někdy zvané shotgun sekvenování, z klinických vzorků byla použita pro různé typy vzorků, včetně mozkomíšního moku, krve, respirační vzorky, gastrointestinálních tekutin, a oční tekutiny.

Jaké jsou Výhody Metagenomic Next Generation Sequencing?,

největší sílu mNGS je, že je objektivní hypotéza-zdarma diagnostická metoda, na rozdíl od cílené polymerázové řetězové reakce (PCR) metody, které se spoléhají na primery pro identifikaci konkrétních cílů, jichž má být zesílen a detekován. Dokonce i univerzální nebo široký-range PCR metody nejsou dostatečně široká, aby být považovány za metagenomic, jak se použití specifických primerů ze zachovaných 16S ribozomální RNA (rRNA) genu a vnitřní přepisována spacer (ITS) sekvence k zesílení charakteristických sekvencí nukleových kyselin, které mohou být bioinformatically zařadit do bakterií/archaea, houby, resp.,
univerzální primery také představují problém při diagnostice polymikrobiálních infekcí molekulárními testy. Pokud jsou polymikrobiální populace přítomny při použití sekvenování 16S, bude na nukleotid provedeno více základních volání, čímž se vytvoří smíšený nukleotidový chromatogram, který nelze interpretovat. Zatímco tam jsou de-konvoluční výpočetní metody k dispozici předvídat organismy zjištěny, nejsou ve standardní použití pro mnoho laboratoří, které často reflex next-generation sekvenování genu pro 16S polymicrobial vzorků.,

jaké jsou výzvy sekvenování nové generace Metagenomic?

a to Navzdory potenciálu mNGS, existuje mnoho překážek jasné před tím, než technologie se může stát součástí hlavního proudu laboratoř, stejně jako mezery v našem chápání, o jeho diagnostické utility. Hlavní výhrady patří výklad zjištění (odlišení kontaminace a kolonizace od skutečné patogeny), výběr a validace databází pro analýzy a predikce (nebo nedostatek thereof) antimikrobiální vnímavosti., Společným vnímáním je, že mNGS je tak neuvěřitelně citlivý, že odhalí diagnózu, když jsou všechny ostatní testy negativní. Zatímco mNGS, může být analyticky citlivější než standardní kultivační metody, v některých případech je nutné odstranění obrovské množství lidských nukleových kyselin během sekvenování příprava a (výpočetní metody) během post-analytický proces, může snížit citlivost v porovnání s cílené PCR přístupy pro mnoho organismů.

specifičnost mNGS zůstává příslovečným slonem v místnosti., Kontaminace vzorků během odběru vzorku je velké znepokojení vzhledem k vyšší analytické citlivosti mNGS v porovnání se standardní kultivační metody, musí být validovány řízení jakosti, proces na místě pro kroky od posuzování čistota činidla k měření dostatečné pokrytí genomu kontroly. Kromě toho, s některými platformami Illumina, mohou být označeny nesprávné indexy čárových kódů, což vede k falešným pozitivům sekvenačních dat., Bioinformatická kontroly kvality jsou potřebné, aby zajistily, že vysoce kvalitní a ověřené genomy jsou k dispozici s minimální chyby databáze a tam by v ideálním případě být bioinformatická personál k dispozici interpretovat výsledky sekvenování pro každý test, který není k dispozici na většině klinických mikrobiologických laboratořích., Federální Drug Administration (FDA) spolupracuje s dalšími federálními agenturami, aby kaplan databáze nazvané FDA-ARGOS (FDA-databáze pro regulační stupeň mikrobiální sekvence), které má být užitečné, aby zajistily, že současné mNGS jsou výsledky spolehlivé a přesné, ale tyto zdroje musí být aktualizovány a udržovány.
větší otázka zůstává kolem klinické specifičnosti MNG: jsou zjištěné sekvence z patogenů, které přispívají k současné nemoci pacienta?, Analytická specifičnost mNGS testování lze řešit pomocí přísné kontroly během odběru vzorku, sekvenování knihovna příprava, test run, a bioinformatická klasifikace, ale klinická specifičnost není přímo řešeny těmito přístupy. Otázky, které mohou pomoci určit klinické prospěšnosti a použitelnosti patří: Jak můžeme rozlišit organismy týkající se přechodné bakteriémie z ústní/gastrointestinální flóry kůže nebo kolonizátory v krvi/plazmě mNGS testování?, Jak by měla být hlášena hloubka sekvenování a jak spolehlivý je vztah hloubky sekvence ke skutečné infekci? Liší se tento vztah patogenem / hostitelem? Jak dlouho je očekávaný detekovatelný poločas patogenu mNGS, jakmile pacient dostane vhodnou léčebnou terapii? Studie o klinické užitečnosti a efektivitě nákladů jsou velmi potřebné navzdory nesporné síle této technologie z hlediska výzkumu a objevu.,
To je také třeba zdůraznit, že neexistují žádné v současné době FDA odbaveno nebo schválené mNGS testy, které mohou být zaslány na mikrobiální testování, i když laboratoře jsou certifikovány podle Klinické Laboratoře Změny Zlepšení z roku 1988 (CLIA ’88), které nabízejí testování na klinických vzorcích. K dnešnímu dni bylo FDA vyčištěno pouze několik diagnostických systémů NGS pro onkologické testování nebo detekci cystické fibrózy., Nedávné recenzi podrobně popisuje mnoho regulačních překážek a úvahy, které budou muset být řešeny před mNGS mohl vstoupit proudu klinické diagnostické laboratoře jako FDA ověřených testů.
stručně řečeno, zatímco mNGS testování může pravděpodobně hrát významnou roli v mikrobiologické diagnostické workflow v budoucnosti, zejména jako sekvenování a bioinformatická výpočetní výkon se vyvíjí, to zůstává vysoká-složitosti technologie, pro které je klinická užitečnost v naší současné lékařské praxi prostředí zůstává nejistý., I když mNGS testování může nabídnout nové a vzrušující diagnostické klinické příležitostí v blízké budoucnosti, nikdo to bude pravděpodobně nahradit bystrý lékař v dohledné době.