Návrh syntetické acetyl-CoA cestou
nejjednodušší způsob, jak syntetizovat organického uhlíku z jednoho uhlíku je postavit jeden po druhém., Za účelem vybudování umělé acetyl-CoA dráhy z jednoho uhlíku jsme navrhli cestu syntetického Acetyl-CoA (SACA), kde by dvě molekuly formaldehydu byly přeneseny do jedné molekuly acetyl-CoA pouze třemi kroky (obr. 1a). Za prvé, formaldehyd by být stlačeny do glykolaldehyd (RÁD) glykolaldehyd syntázy (HOLKY). A pak by se glykolaldehyd přeměnil na acetyl-fosfát (AcP) acetyl-fosfátovou syntázou (ACPS) za použití anorganického fosfátu. Nakonec by akt byl použit k výrobě acetyl-CoA známým enzymem fosfát acetyltransferáza (PTA)25., Mezitím lze formaldehyd získat snížením oxidu uhličitého a formate26 nebo oxidací metanu a methanol27. Mohli bychom tedy realizovat biosyntézu acetyl-CoA z formaldehydu a dokonce i dalších jedno-uhlíkových zdrojů.
Popis a výpočetní analýza SACA dráhy. v červeném panelu byla zvýrazněna cesta SACA. Hlavní surovinou formaldehydu může být methanol, formát a dokonce metan a CO2., Produkt acetyl-CoA by mohl být použit k výrobě hlavních buněčných živin. b termodynamické údaje ze tří navrženy cesty pro acetyl-CoA syntéza vytvořených stránkách eQuilibrator (http://equilibrator.weizmann.ac.il)., ΔrG jsem: celkové gibbsovy energie změna, Takto: počet reakcí z formaldehydu na acetyl-CoA v studovali dráhy; MDF: maximální hnací síla; Výnosy: celkový výnos z uhlíku ve zkoumaných cest; Koenzymů: počet enzymů se používá v studovali cesty,
termodynamiky může odrážet skutečnost, zda se cesta mohla být účinně prováděny in vivo nebo in vitro. Vypočítali jsme termodynamickou chemickou hnací sílu navržené cesty SACA., Celková reakce z formaldehydu na acetyl-CoA, který je vysoce termodynamicky příznivá, kde celková změna gibbsovy energie (ΔrG m) celá reakce je o -96.7 kJ mol−1 (Obr. 1b a doplňková Tabulka 1). Hodnota MDF (maximální hnací síla) se obvykle používá k vyhodnocení termodynamické a kinetické kvality různých cest28. Pokud je MDF dostatečně vysoká, cesta neobsahuje žádné termodynamické překážky, které by bránily jeho provozu in vivo. Cesta SACA získala relativně vysokou hodnotu MDF 26.,9 kJ mol-1, který je zjevně vyšší než dráhy FLS a MCC(jejich hodnoty MDF jsou 1,9 a 5,8 kJ mol-1). Proto je cesta SACA termodynamicky příznivá pro biosyntézu acetyl-CoA z formaldehydu.
Identifikaci nových enzymů z C1 do C2
kondenzaci formaldehydu může být katalyzována N-heterocyklické karabina v chemistry29,30. V biologii má thiazoliový kruh kofaktoru thiamin difosfát (ThDP) podobnou funkci, která by mohla aktivovat jeden aldehyd a poté vytvořit dimer s jiným aldehydem31., Ve snaze najít enzym kondenzují dvě molekuly formaldehydu do jedné molekuly glykolaldehyd, jsme uvedené katalytické mechanismy ThDP-dependentní enzymy a postavena theozyme model, který zahrnuje ThDP, glykolaldehyd, a kyselina glutamová, která poskytuje elektronový pro reaction32 (Obr. 2a). Všechny enzymy v proteinové datové bance (PDB) byly prakticky testovány na základě modelu theozyme a bylo dosaženo 37 redundantních proteinových struktur s ligandem ThDP (Doplňkový Obr. 1 a doplňková Poznámka)., Podle katalytických mechanismů enzymů závislých na Thdp33, 34, 35, atom C2 v thdp je aktivní centrum. Vzdálenost mezi atomem C2 a produktem glykolaldehydu je kritická pro spuštění katalytické reakce (obr. 2a). Analyzovali jsme tedy vzdálenost mezi atomem C2 a glykolaldehydem v každém kandidátském proteinu.
konstrukce modelu a funkční identifikace syntázy glykolaldehydu., a theozymový model interakce mezi glykolaldehydem a aktivními centry různých enzymů závislých na ThDP. Glutamát (glu) je tan; glykolaldehyd je azurový; ThDP je zelená. Vzdálenosti mezi atomem C2 v atomech thdp a glykolaldehydu jsou reprezentovány D1 a d2. Zelená tečka je iont hořčíku. b průměrné vzdálenosti (modrá) mezi d1 a d2 v každém proteinu jsou zobrazeny vlevo. Množství produktu (žluté) pro testovaný protein je zobrazeno vpravo. Reakce byla provedena přidáním 1 mg mL-1 testovaných proteinů a 2 g l−1 formaldehydu. ND žádná detekce., Chybové pruhy představují s. d. (směrodatná odchylka), n = 3. C proteinová exprese tří funkčních kandidátů pomocí 1 mL 1 OD buněk. M: protein marker; 1, 3 a 5 představují exprese proteinů bez IPTG pro 2UZ1, 3FZN, a 4K9Q, v uvedeném pořadí; 2, 4, a 6 představují exprese proteinů v rámci indukci IPTG pro 2UZ1, 3FZN, a 4K9Q, respektive; červené šipky poukazují na bílkoviny pásma pro 2UZ1, 3FZN, a 4K9Q, resp. Zdrojová data jsou poskytována jako zdrojový datový soubor.,
na Základě průměrné vzdálenosti v jednotlivých proteinů pomocí molekulární dokování (Doplňující Údaje 1)36, šest kandidátů s na krátké vzdálenosti a jasné funkční popisy byly definovány jako kandidáti (Obr. 2b a doplňková Tabulka 2). Kromě toho byly jako ovládací prvky náhodně vybrány tři proteiny s dlouhými vzdálenostmi. Kandidáti a kontroly byly vyjádřeny a vyčištěny, aby se otestovala jejich schopnost produkovat glykolaldehyd z formaldehydu., Tři ze šesti kandidátů vykazovali požadovanou aktivitu, zatímco tři ovládací prvky neměl funkci, označující vzdálenost mezi C2 atom a glykolaldehyd hraje rozhodující roli na kondenzaci formaldehydu. Mezi tři aktivní kandidáty, protein 2UZ1 (https://www.rcsb.org/structure/2UZ1), které bylo nazváno benzaldehydu lyasy (BAL), oznámil, že se přednostně vytvářet dihydroxyaceton (DHA) a to i přes minimální výnos glykolaldehyd, když koncentrace formaldehydu byl lower37., The other two proteins 3FZN (https://www.rcsb.org/structure/3FZN) and 4K9Q (https://www.rcsb.org/structure/4K9Q) that produce glycolaldehyde from formaldehyde were named as benzoylformate decarboxylases (BFD) in PDB database. And BFD (3FZN) from Pseudomonas putida was selected as candidate for subsequent modification since it has higher activity and expression level (Fig. 2c).,
Směřovat vývoj glykolaldehyd syntázy
Od BAL byl navržen tak, aby produkovat DHA z formaldehyde22, navrhli jsme, aby zjistit, zda odpovídající mutace v PD by také přispět ke zlepšení aktivity enzymu (Doplňkový Obr. 2). Screeningem všech mutovaných zbytků jsme skutečně našli vysoce aktivní mutaci W86R-N87T, která byla umístěna v substrátovém kanálu BFD(Doplňkový obr. 3). Tato mutace (W86R-N87T) byla tedy zavedena do BFD a varianta byla označena jako M1., V zájmu dalšího zlepšení katalytickou aktivitu z PD, navrhli jsme, aby obrazovky všech zbytků v okolí aktivního centra BFD, kde 25 pozic v rámci 8 Å vzdálenost od aktivního centra byly vybrány udělat jeden-bod nasycení mutageneze (Doplňkový Obr. 4). Jsme vyvinuli high-throughput screening pro detekci glykolaldehyd barevnou reakcí mezi glykolaldehyd a difenylamin, které bylo měřeno spektrofotometricky sledovat na 650 nm (Doplňkový Obr. 5)., Po screeningu jsme zjistili, že 14 z 25 pozic vykazovalo vyšší aktivity než mutant M1 (Doplňkový obr. 6). Následně, 14 pozice byly rozděleny do 8 skupin: (N27/G402), B (N27/S236), C (N27/A460), D (F397/C398), E (L109/L110), F (H281/Q282), G (N374/S378), a H (T379/T380). N27 byl použit třikrát, protože varianty v této poloze zobrazovaly nejvyšší aktivitu. Pomocí M1 jako šablony jsme zavedli každou skupinu mutací do M1 a vybrali nejvyšší aktivní mutant, který byl označen jako M2., Provedením třech kolech iterativní kombinatorické mutageneze mezi tyto pozice, jsme naprosto promítán 64,512 klonů a získat vysoké aktivitě mutant, který obsahuje pět nových mutací kolem aktivního centra. Nakonec byla varianta se 7 mutacemi reziduí pojmenována jako glykolaldehyd syntáza (GALS). Na kcat z HOLEK byla lepší asi 160-krát a poslední katalytické účinnosti HOLKY je 9,6 M−1·s−1, což je zhruba 70-krát, než je výchozí enzym (Obr. 3a a doplňkový Obr. 7).
Proteinové inženýrství a mechanismus analýza glykolaldehyd syntázy. kinetické parametry WT a mutantů. WT: wild type; M1: mutace v W86R a N87T; M2: mutace v W86R, N87T, L109G, a L110E; M3: mutace v W86R, N87T, L109G, L110E a A460M; M4: mutace v W86R, N87T, L109G, L110E, A460M, H281V, a Q282F. b přehled vybraných pět mutací v aktivním centru. IMA: mezilehlý Analog; oranžové čáry označují vodíkové vazby mezi hydroxylovou skupinou IMA a mutací L110E., c objemy kapes M1, M2, M3 a M4. Růžové tečky představují objemy závazných kapsy (Doplňující Údaje 2), které jsou 131.25, 161.50, 133.38, a 171.38 Å3, resp. Údaje byly vykresleny pomocí UCSF Chimera Software verze 1.1246. Zdrojová data jsou poskytována jako zdrojový datový soubor.
abychom zjistili, jak tyto mutace zlepšují enzymovou aktivitu, Navrhli jsme znovu krystalizaci GALS. Aktivní kapsa se nachází na rozhraní homodimeru GALS38., Proteinová struktura Galů se může lišit od výchozího proteinu po několika kolech mutace. Zde jsme krystalického proteinu HOLKY a získat krystalové struktury HOLKY pomocí struktury BFD jako hledání modelu (Doplňující Tabulka 3). Byla analyzována krystalová struktura Galů (Doplňkový Obr. 8, Doplňkový Obr. 9). Zjistili jsme, že mutace L110E zavádí dva další vodíkové můstky na hydroxylové skupiny intermediate analogové (IMA), což může přispět ke stabilizaci přechodového stavu a štěpení C–C vazby mezi produktem a kofaktor ThDP (Obr. 3b)., Mutace L109G zvětšila objem substrátové vazebné kapsy nahrazením velké isobutylové skupiny vodíkovou skupinou. Třetí mutace A460M může substrát přeorientovat a poté zvýšit interakci mezi ThDP a substrátem. Poslední dvě mutace H281V a Q282F rozšířily poloměr pórů vnějšího povrchu a mohou usnadnit přístup k substrátu nebo produktu(obr. 3c). Srovnání s M1, objem reakce kapsa na HOLKY byl rozšířen o více než 30%, což by mělo být hlavním důvodem pro zlepšení katalytické aktivity.,
Identifikace acetyl-fosfát syntáza
V přírodě, bez enzymu byl hlášen k dosažení syntézy Akt z glykolaldehyd. Fosfoketolázy (PKs) mohou produkovat akt z fruktózy-6-fosfátu (F6P)nebo xylulózy-5-fosfátu (X5P) 39. Podle katalytického mechanismu PKs, je možné, že glykolaldehyd interaguje s ThDP a pak generuje 2-α,β-dihydroxyethylidene-ThDP (DHEThDP) (Obr. 4a), což je klíčový meziprodukt tvorby AcP z F6P nebo X5P pomocí PKs. Pro potvrzení naší hypotézy jsme vybrali osm kandidátů (obr., 4b) na základě fylogenetického stromu PKS ze 111 bakteriálních rodin (Doplňkový Obr. 10). Po syntéze genů a purifikaci proteinů (Doplňkový Obr. 11), zkoumali jsme katalytickou aktivitu všech kandidátských proteinů pomocí glykolaldehydu jako substrátu. Naštěstí pět z osmi PK vykazovalo významné katalytické aktivity. Pouze PK1, PK4 a PK8 nevykazovaly významný rozdíl od prázdného ovládání. Tak, PK2 s nejvyšší aktivita byla označována jako acetyl-fosfát syntázu (zemí akt), jehož kcat/Km dosahuje na 3,21 M−1·s−1 (Doplňkový Obr. 12).,
Výpočetní analýzy a funkční identifikace acetyl-fosfát syntázu. a tvorba DHEThDP z F6P / X5P a glykolaldehydu. Pevné šipky představují mechanismus tvorby DHEThDP v ref. 39; přerušované šipky označují předpokládaný proces pomocí glykolaldehydu jako substrátu. b identifikace akt. Maximální pravděpodobnost fylogenetického stromu vybraných osmi PKs byla zkonstruována MEGA47., Podrobnosti o vybraných PK jsou uvedeny v doplňkové poznámce a doplňkovém obr. 10. Aktivita každého proteinu byla zjištěna přidáním 0,5 mg ml−1 enzymu a 10 mm glykolaldehydu. Akt acetyl-fosfát, PK phosphoketolase, Výroba Akt (µmol min−1 mg−1): množství Akt vyrábí na mg enzymu za minutu; Ovládání: ne enzymu byl přidán do reakční soustavy; Chybové úsečky představují s.d. (standardní odchylka), n = 3. c energetický profil pro proces tvorby DHEThDP., IM1 a IM2 představují intermediate 1 a 2 během procesu tvorby; TIM představuje tautomerized přechodný mezi IM1 a IM2; TS1 a TS2 představují přechod státy. Zdrojová data jsou poskytována jako zdrojový datový soubor.
odhalit mechanismus formování DHEThDP z glykolaldehyd, navrhli jsme provést teoretickou analýzu na základě předchozí výpočetní model PK40. Pro konstrukci výpočetního modelu byly použity všechny možné aminokyseliny související s tvorbou DHEThDP(Doplňkový obr. 13)., Na základě počítačové simulace jsme zjistili, že energetická bariéra je pouze 11.36 kcal mol−1 pro tvorbu IM1 (intermediate 1), když glykolaldehyd byl protonované tím, His553, který byl považován za nejvíce možné proton donor40 (Obr. 4c). Pak IM1 tautomerizes do IM2 s pomocí Glu479 a Glu437. IM2 je energeticky stabilnější než IM1. Když byl proton IM2 odstraněn N4 ‚ v ThDP, energetická bariéra z IM2 na klíčový meziprodukt DHEThDP je 15.,13 kcal mol-1, který je podobný jako energie kmene během tvorby DHEThDP pomocí F6P jako substrát40. Po vytvoření DHEThDP jsou následující katalytické procesy stejné jako ostatní PKs (Doplňkový obr. 14), tzn., H97 působí jako proton dárce dehydratace proces DHEThDP, a His142 a Gly155 urychlení dehydratace proces DHEThDP, soudě podle skutečnosti, že His142 a Gly155 tvořit vodíkové vazby s molekuly vody ve struktuře post-dehydratace intermediate (AcThDP)., His64, Tyr501 a Asn549 jsou důležité pro nukleofilní útok Pi a společně tvoří vazebné místo Pi39. Experimenty zaměřené na mutagenezi v místě také ukázaly, že tato rezidua jsou klíčová pro enzymovou aktivitu (Doplňkový Obr. 15).
Syntéza acetyl-CoA z formaldehydu in vitro
S počáteční úspěšný design HOLEK a země akt, chtěli jsme postavit SACA dráhy in vitro syntetizovat acetyl-CoA z formaldehydu. Nejprve jsme měřili výtěžnost glykolaldehydu pomocí Galů za různých koncentrací formaldehydu., Výsledky ukázaly, že GALS může účinně katalyzovat dimerizaci formaldehydu a výtěžnost glykolaldehydu se zvýšila s koncentrací substrátu (obr. 5a). Například výtěžek glykolaldehydu z formaldehydu se zvýšil ze 45% při 0,5 g L-1 na 80% při 2 g L−1. Za druhé, jsme se zabývali katalytické účinnosti od glykolaldehyd Akt, který byl kvantifikován obsah kyseliny octové, protože Akt by být rychle degradovány na kyselinu octovou (Doplňkový Obr. 16)23., Výsledky ukázaly, že výtěžnost Akt dosáhla více než 80% při různých koncentracích glykolaldehydu prostřednictvím ACPS (Doplňkový Obr. 17). Bohužel, ACPS byl zjevně inhibován formaldehydem(obr. 5b). Při řešení tohoto konfliktu je tedy nutné vzít rovnováhu pro koncentraci formaldehydu.
Potvrzení biosyntézy acetyl-CoA z formaldehydu podle SACA dráhy in vitro. a syntéza glykolaldehydu z formaldehydu GALS., Reakce byly provedeny za různých koncentrací formaldehydu s 2 mg ml−1 purifikovanými GALS při 37 ° C po dobu 2 h. B inhibice ACPS formaldehydem. Výnosy z kyseliny octové byly měřeny v různých časových bodech s reakční pufr, 2 mg mL−1 země akt, 0,75 g L−1 glykolaldehyd a ten gradient formaldehydu od 0 do 2 g L−1, který byl reprezentován jinou barvu linky. C výtěžek kyseliny octové z různých koncentrací formaldehydu. Reakce byly prováděny při 37 ° C přes noc s reakčním pufrem, 2 mg mL-1 GALS, 2 mg mL-1 ACPS a gradient formaldehydu od 0.,5 až 2 g L-1. D výtěžek kyseliny octové nebo acetyl-CoA z 1 g l−1 formaldehydu. Výnosy kyseliny octové nebo acetyl-CoA byly měřeny v různých časových bodech. Modrá čára představuje reakci systému na výrobu acetyl-CoA (s 20 mM CoA krmení a obsahující 2 mg mL−1 na čištěný HOLKY, zemích akt, a PTA, v tomto pořadí); oranžová čára představuje reakci systému na výrobu kyseliny octové (obsahující 2 mg mL−1 HOLKY a země akt a bez CoA krmení). Vzorky ve všech testech byly analyzovány HPLC. Chybové pruhy představují s. d. (směrodatná odchylka), n = 3., Zdrojová data jsou poskytována jako zdrojový datový soubor.
Za účelem optimalizace koncentrace formaldehydu, gradient experimentu bylo provedeno pomocí reakce systém, který obsahuje 2 mg mL−1 HOLEK a zemí akt. Se zvýšením koncentrace formaldehydu se výtěžek kyseliny octové v systému zpočátku zvýšil a poté se snížil (obr. 5c). Když je koncentrace formaldehydu 1 g L-1, výtěžek kyseliny octové dosáhl 50,6%., Je zajímavé, že konečný výtěžek kyseliny octové je ještě vyšší než v reakčním systému od glykolaldehydu po akt se stejným množstvím formaldehydu(obr. 5b, šedivý). To by bylo způsobeno částečným uvolněním funkce ACPS, protože formaldehyd byl postupně spotřebován GALS. Na základě tohoto systému jsme dále přidali další známý enzym fosfát acetyltransferázu (PTA), která by převést Akt na acetyl-CoA. Nakonec cesta SACA produkovala 5,5 mM acetyl-CoA při koncentraci formaldehydu 1 g L-1. Výtěžek acetyl-CoA z formaldehydu byl asi 33% (obr. 5d)., Výtěžnost kyseliny octové (7,8 mM) z formaldehydu (33,3 mM) však dosáhla 50%, pokud nebyly dodány PTA a CoA. Nižší výtěžek acetyl-CoA než výtěžek kyseliny octové by byl způsoben nestabilitou acetyl-CoA a AcP. Naše výsledky ukázaly, že je úspěšný pro biosyntézu acetyl-CoA z formaldehydu cestou SACA in vitro.,
Ověření SACA cestou podle 13C-značení
Po zjištění SACA dráhy s purifikované enzymy in vitro, jsme se dále pokusili test syntéza acetyl-CoA a je to deriváty od SACA dráhy in vivo pomocí 13C-metabolický tracer testy (Obr. 6a). Za prvé, buněčné lyzáty byly použity k ověření biosyntézy acetyl-CoA přidáním formaldehydu značeného 13C a CoA. Zjistili jsme významné zvýšení dvojitého acetyl-CoA značeného 13C než jiné ovládací prvky (hodnota P < 0.001, t-test) (obr. 6b a doplňkový Obr. 18)., Kromě toho zvýšení dvojitého acetyl-CoA značeného 13C zmizelo, pokud jsme vynechali jeden z genů v SACA dráze, jako jsou ACPS a PTA (Doplňkový obr. 19). Kromě toho, acetyl-CoA by sblížil s oxalacetátu vstoupit trikarboxylová (KREBSOVA) cyklu. Také byl zjištěn významně více dvojných 13C-značené fumarát (P-hodnota < 0.001, T-test) a malát (P-hodnota < 0.001, T-test), pouze v kmen s SACA dráhy a 13C-značené formaldehyd krmení (Obr. 6b a doplňkový Obr. 18)., Nezjistili jsme však významné rozdíly v izotopomerech s vyšší hmotností. Bylo by to způsobeno nízkým množstvím dvojitých izotopomerů označených 13C v cyklu TCA.
13C-značené metabolické tracer analýza SACA dráhy. schematické schéma testované dráhy pro 13C značený tracer. b frakce sloučenin m + 2 v buněčných lyzátech s 13C značeným nebo neznačeným formaldehydem. c frakce metabolitů značených 13C., Buňky byly indukovány v LB a přeneseny do média M9 obsahujícího methanol označený 13C. Intracelulární metabolity byly detekovány po 16 h inkubaci a proteinogenní aminokyseliny byly měřeny po 26 h inkubaci. Součet zjištěných izotopomerů byl stanoven na 100%., 13C-FALD 13C-značené formaldehyd, m + 0 bez 13C značení, m + 1 jeden 13C značení, m + 2 double 13C značení, FALD formaldehyd, MeOH methanol, RÁDA, glykolaldehyd, Akt acetyl-fosfát, Asp aspartát, Glu glutamátu, PEP fosfoenolpyruvátu, ŠACA kmen obsahuje vektor HOLKY-země akt-PTA-28a 28a kmen obsahuje prázdný vektor 28a, BsMDH-ŠACA kmen obsahuje jak BsMDH-pCDF a HOLKY-země akt-PTA-28a vektorů, BsMDH-28a: kmen obsahuje jak BsMDH-pCDF vektorové a prázdný vektor 28a. Chybové úsečky představují s.d. (standardní odchylka), n = 3., Zdrojová data jsou poskytována jako zdrojový datový soubor.
následně jsme navrhli otestovat tok uhlíku v buňkách. Vzhledem k toxicitě formaldehydu na buňky, jsme zavedli methanol dehydrogenázy z Bacillus stearothermophilus (BsMDH)41 udržovat trvale nízké koncentrace formaldehydu in vivo (Obr. 6a). Kultivované buňky byly sklizeny v různých časových bodech a byly použity k detekci proteinogenních aminokyselin a intracelulárních metabolitů(obr. 6c)., Zjistili jsme, že kmen s cestou SACA (BsMDH-SACA) obsahoval více dvojitého aspartátu značeného 13C a glutamátu, který pocházel z cyklu TCA. Kromě toho, 13C-značené glukózy a fosfoenolpyruvátu, což by mohlo generovat z dvojité 13C-značené oxalacetátu prostřednictvím glukoneogeneze dráhy, byly zjištěny více v napětí BsMDH-ŠACA než v kontrolní kmen (BsMDH-28a). Naše výsledky tedy ukázaly, že cesta SACA je funkční pro výrobu metabolitů acetyl-CoA a acetyl-CoA odvozených z formaldehydu.,
vyhodnocení cesty SACA buněčným růstem
abychom mohli dále vyhodnotit cestu SACA in vivo, Navrhli jsme postupně testovat růst buněk podáváním každého meziproduktu v cestě. Zpočátku E. coli vyrostl pod bohatým médiem a poté byl jako doplňkový zdroj uhlíku přidán glykolaldehyd. Přidáním různých koncentrací glykolaldehydu (Doplňkový Obr. 20), zjistili jsme, že inženýrství kmen, který obsahuje SACA dráhu s více než 0.,4 g L−1 glykolaldehyd nabídky má pozoruhodné vyšší OD600 než ty kmeny bez glykolaldehyd nebo SACA dráhy (Obr. 7a a doplňkový Obr. 21). Příspěvek glykolaldehyd na biomasu (buněčné sušiny, CDW) byl 0.681 ± 0.028 gCDWg−1 (n = 3) glykolaldehyd.
hodnocení cesty SACA buněčným růstem. analýza růstu buněk za použití 0,4 g l−1 glykolaldehydu jako doplňkového zdroje uhlíku., testy růstu B buněk za použití 80 mg L−1 formaldehydu jako doplňkového zdroje uhlíku. C analýza růstu buněk za použití 8 g l−1 methanolu jako doplňkového zdroje uhlíku. Buňky byly původně kultivovány v LB médiu. IPTG byl přidán k indukci proteinové exprese a poté byly přidány doplňkové zdroje uhlíku. OD600 byl detekován v různých časových bodech., SACA kmen obsahuje vektor HOLKY-země akt-PTA-28a 28a kmen obsahuje prázdný vektor 28a, BsMDH-ŠACA kmen zahrnuje jak BsMDH-pCDF a HOLKY-země akt-PTA-28a vektorů, BsMDH-28a kmen obsahuje jak BsMDH-pCDF vektorové a prázdný vektor 28a, Ne HOLKY kmen obsahuje všechny geny v cestě, kromě HOLEK, + přidání doplňkového zdroje uhlíku, − bez doplňkového zdroje uhlíku, glykolaldehyd (RÁD), formaldehyd (FALD), methanol (MeOH). Chybové pruhy představují s. d. (směrodatná odchylka), n = 3. Zdrojová data jsou poskytována jako zdrojový datový soubor.,
Když testovali jsme růst buněk za použití formaldehydu jako doplňkové zdroje uhlíku, růst, kmen s prázdným vektorem byla zcela inhibována 80 mg L−1 formaldehydu (Obr. 7b). Kmen obsahující SACA cesta byla inhibována zpočátku a pak vyrostl normálně za stejných podmínek, což může být způsobeno jeho rychleji formaldehydu spotřebu než kmen s prázdným vektorem (Doplňkový Obr. 22)., Bohužel kmen obsahující SACA pathway neměl více biomasy s přídavkem formaldehydu než ty bez formaldehydu. Tyto výsledky ukázaly, že ačkoli cesta SACA je účinnější pro odstranění toxického formaldehydu, nestačí poskytnout biomasu.
nakonec jsme zamýšleli vyhodnotit cestu SACA podáváním methanolu, který by byl nepřetržitě přeměněn na formaldehyd. Zjistili jsme, že kmen obsahující jak bsmdh, tak SACA pathway má vyšší OD600 než ty kontroly bez dodávky methanolu nebo cesty SACA (obr. 7c a doplňkový Obr., 23). Po 26 h inkubace, jsme zjistili, že hodnota OD600 v kmen obsahující jak BsMDH a SACA cesta zvýšil o 0,2, což je podstatně vyšší než napětí bez SACA dráhy (P-hodnota = 0.005, T-test). Porovnáním s kmenem bez SACA cestu, zjistili jsme, že množství biomasy získané z methanolu byla 0,03 ± 0.006 gCDW g−1 (n = 3) a methanolu v kmen, který obsahuje SACA dráhy.